Protocole traduit in vitro d'analyse de kinase de MOS de Xenopus

Protocole traduit in vitro d'analyse de kinase de MOS de Xenopus

Protocole in vitro de traduction de kinase de MOS de Xenopus

•  Traduisez le MOS étiqueté dans un extrait de CSF (voir le protocole relatif à la préparation d'extrait de CSF et voir l'extrémité #1).

Anticorps à l'attache d'antigène

1. Diluez l'extrait au moins quintuple dans la mémoire tampon de la kinase H1.
2. Ajoutez une quantité suffisante d'anticorps qui identifie l'étiquette utilisée en construisant la protéine étiquetée de MOS (voyez Tip#2).
3. Incubez sur la glace pour 1 heure (voyez Tip#3).

Protéine un protocole obligatoire d'anticorps de sépharose

1. Équilibrez la protéine des programmes de la sépharose un 6MB (Pharmacia) avec la mémoire tampon de la kinase H1 en suspendant les programmes dans la mémoire tampon (voir l'extrémité #4).
2.  Centrifugez pour sec 30 ou moins dans un microcentrifuge pour granuler les programmes.
3. Retirez le surnageant et répétez les étapes #C1 et #C2 deux fois supplémentaires.
4.  Resuspendez les programmes dans la mémoire tampon de la kinase H1 pour donner une boue de 50% de programmes.
5. Pour déterminer combien de protéine une sépharose à utiliser, considèrent combien de réactions de kinase seront effectuées avec chaque immunoprecipitate. Il est important que chacun des tubes de réaction de kinase reçoive le μl environ 10 des programmes emballés. Ainsi, si une immunoprécipitation doit être dédoublée 4 voies, utilisez le μl 80 d'une suspension de 50% de protéine une sépharose pour la protéine une sépharose/étape obligatoire d'anticorps. Pour ces calculs, il n'est pas important de considérer l'affinité obligatoire de la protéine une sépharose (voyez Tip#5).
6. Partie aliquote la protéine mémoire-équilibrée qu'une sépharose perle dans des tubes de microcentrifuge. Utilisez les tubes de 0.6 ml si le volume sera moins de 0.5 ml ; autrement, utilisez les tubes de 1.5 ml.
7.  Centrifugez la solution d'anticorps/extrait à la vitesse maximum pour la minute 2 dans un microcentrifuge pour granuler n'importe quel matériel insoluble (voyez Tip#6).
8. Ajoutez le surnageant à la protéine une boue de sépharose.
9.   Incubez pour la minute 30 à la température ambiante avec le mélange de fin-au-dessus-fin. Pour assurer le bon mélange pendant l'incubation, remplissez tubes trois quarts complètement de sorte qu'un bulle d'air se déplace à travers le tube, en mélangeant continuellement le contenu.
10.  Centrifugez les échantillons pour sec 30 ou moins dans un microcentrifuge pour granuler les programmes.
11.   Lavez les programmes en resuspendant dans la mémoire tampon de lavage. Remplissez tube trois quarts complètement.
12.   Centrifugez les échantillons pour des 30 ou moins dans un microcentrifuge pour granuler les programmes et pour retirer le surnageant.
13.   Resuspendez les programmes dans la mémoire tampon de lavage de nouveau et transférez les programmes à un nouveau tube.
14.   Rincez les vieux tubes avec plus de mémoire tampon de lavage et ajoutez ce lavage aux nouveaux tubes.
15.   Centrifugez les programmes pour sec 30 ou moins dans un microcentrifuge pour granuler les programmes et pour retirer le surnageant.
16.   Lavez de nouveau avec la mémoire tampon de lavage et centrifugez les programmes pour sec 30 ou moins dans un microcentrifuge et retirez le surnageant.

Réactions de kinase sur le matériel d'Immunoprecipitated

1. Lavez les programmes un ou deux fois dans la mémoire tampon de réaction de la kinase H1.
2. Aspirez outre de tout les surnageant.
3. Ajoutez le μCi γ 10 le μl de la mémoire tampon de réaction de la kinase H1 contenant le triphosphate d'adénosine de 20 μM et 5 - [32P] - triphosphate d'adénosine (ATTENTION ! voyez Tip#7).
4. Incubez la réaction pour la minute 10 à 30°C.
5. Arrêtez la réaction en ajoutant le μl 10 de la mémoire tampon témoin 2X.
6. Μl du chargement 8 de l'échantillon sur un gel de polyacrylamide de 15% (voir le protocole relatif à SDS-PAGE).
7. Exécutez le gel et traitez-le pour l'autoradiographie (voir le protocole relatif à l'autoradiographie).

Analyse de gel de polyacrylamide de protocole d'immunoprécipitation

1. Resuspendez les programmes dans la mémoire tampon témoin 1X.
2. Bouillez les échantillons pour sec 90.
3. Centrifugez les échantillons brièvement dans un microcentrifuge.
4. Chargez les échantillons sur un gel de SDS-Polyacrylamide (voir le protocole relatif à SDS-PAGE).
5. Electrophorese le gel.
6. Séchez le gel sur un dessiccateur de gel.
7. Détectez l'activité de kinase par l'autoradiographie (voir le protocole relatif à l'autoradiographie).

Mémoires tampons pour le protocole d'analyse de kinase

Mémoire tampon de la kinase H1		1 millimètre DTT (pour maintenir l'activité de la protéine) 20 millimètres EGTA 15 millimètres de mgcl2 80 millimètres de glycérol 2-Phosphate, sel de sodium, pH 7.4
Mémoire tampon témoin (2X)		2 millimètres DTT Ajoutez DTT juste avant l'utilisation glycérol de 20% (v/v) 100 millimètres de Tris-Cl, pH 6.8 0.2% bleu du bromophénol (poids/volume) 4% (poids/volume) SDS
Mémoire tampon de réaction de la kinase H1		15 millimètres de mgcl2 1 millimètre DTT 20 millimètres HEPES, pH 7.4 150 millimètres de NaCl
Mémoire tampon de lavage		1 millimètre DTT 0.1% (v/v) Triton-x 100 5 millimètres EGTA 50 millimètres de Tris-Cl, pH 7.4 5 millimètres Naf 250 millimètres de NaCl

  Matériaux requis pour la méthode

• Triton-x 100
• Bleu de bromophénol
• Glycérol
• Tris
• Chlorure de magnésium
• I3- [^32P] - triphosphate d'adénosine
• DTT
• Anticorps
• EGTA
• Triphosphate d'adénosine
• Fluorure de sodium
• Glycérol 2-Phosphate, sel de sodium
• Chlorure de sodium
• Protéine une sépharose
• SDS
• HEPES

Extrémités de protocole

Références pour le protocole d'analyse de kinase