Extraction de Chloroforme Acide de Phénol d'Isolement d'ARN de Sulfocyanate de Guanidinium

Extraction de Chloroforme Acide de Phénol d'Isolement d'ARN de Sulfocyanate de Guanidinium

Méthode d'Isolement d'ARN :

Protocole Pas à pas d'Isolement d'ARN

1. Pour l'usage de cellules de culture de tissu mammifère 1 ml dénaturant la solution par 1 x 107 cellules. Pour des cellules de drosophile nous 1 ml dénaturant la solution par 1 x 108 cellules. Pour les embryons ou le tissu, utilisez 1 ml dénaturant la solution par tissu du magnésium 100 (voir l'extrémité # 2).
2.  Homogénéisez les cellules de culture de tissu ou de cellules en utilisant un homogénisateur de Teflon-verre ou un homogénisateur de polytron.
3. Transférez l'homogénat à un tube de polypropylène de 5 ml.
4. Ajoutez 0.1 ml d'acétate de sodium de 2 M et mélangez complètement par inversion.
5.  Ajoutez 1 ml de phénol saturé par ddH2O, mélangez bien par inversion, ajoutez 0.2 ml de SEVAG et mélangez bien par inversion.
6.  Incubez la suspension pendant 15 minutes à 0° au °C 4 (voir l'extrémité # 3).
7.  Centrifugez la solution à 10.000 X g à 4°C pendant 20 minutes (9.000 t/mn à l'aide d'un rotor SS-34).
8.  Transférez la phase supérieure (aqueuse) à un tube frais (voir l'extrémité # 4).
9.  Précipitez l'ARN en ajoutant 1 ml (1 volume) de l'isopropanol 100% (température ambiante).
10.  Placez les échantillons à -20°C pendant 30 minutes.
11.  Centrifugez la solution à 10.000 X g à 4°C pendant 20 minutes (9.000 t/mn à l'aide d'un rotor SS-34) et jetez le surnageant.
12. Dissolvez le granule d'ARN en 0.3 ml dénaturant la solution et le transférez à un tube de microcentrifuge de 1.5 ml.
13.  À l'ARN, reprécipitez l'ARN en ajoutant 0.3 ml de l'isopropanol 100% et l'incubation à -20°C pendant 30 minutes.
14.  Centrifugez la solution à 10.000 X g à 4°C pendant 20 minutes (9.000 t/mn à l'aide d'un rotor SS-34) et jetez le surnageant.
15. Au granule ajoutez 1 ml d'éthanol de 75%, mélangez bien et incubez pendant 5 à 10 minutes à la température ambiante.
16.  Centrifugez la solution à 10.000 X g à 4°C pendant 20 minutes (9.000 t/mn à l'aide d'un rotor SS-34) et jetez le surnageant.
17. Resuspendez le granule d'ARN en éthanol de 75% à la température ambiante, mélangez bien par inversion et incubez à la température ambiante pendant entre 5 à 10 minutes à la température ambiante.
18.  Centrifugez la solution à 10.000 X g à 4°C pendant 20 minutes (9.000 t/mn à l'aide d'un rotor SS-34) et jetez le surnageant.
19.  Séchez le granule d'ARN dans une centrifugeuse de vide pendant 5 à 15 minutes.
20. Dissolvez le granule d'ARN en 50 à 100 μl ddH2O.
21.  Dosez l'ARN en mesurant l'absorbance à 260 nm (voir le protocole relatif à la quantification de l'ARN) et entreposé dans les parties aliquotes à -70°C.

Mémoires tampons d'Isolement d'ARN

phénolsaturépar O du ddH 2		Volumes égaux de cartel du ddH2O et du phénol (n'utilisez pas le phénol neutralisé) dans une bouteille en verre brune Utilisez le phénol Mélangez bien et incubez à 4°C durant la nuit
éthanol de 70% (v/v)
éthanol de 75% (v/v)
SEVAG		Alcool de 24:1 Chloroform:Isoamyl
Acétate de Sodium de 2 M		Autoclave pH à l'acide 4.0 acétique glaciaire d'utilisation
10% Sarkosyl		sel de sodium de 10% (w/v) N-Lauroylsarcosine
Dénaturer La Solution		0.1 M 2-Mercaptoethanol * 0.5% (w/v) sel de sodium de N-Lauroylsarcosinate Sulfocyanate de 4 M Guanidinium (ATTENTION ! voir l'extrémité # 1) * Ajoutez juste avant l'utilisation 25 millimètres de citrate sodique, pH 7.0
0.75 Citrate sodique de M

Les matériaux ont eu besoin pour le protocole d'isolement d'ARN

• Citrate sodique
• Sulfocyanate de Guanidinium
• Sarkosyl
• Alcool Isoamylique
• Éthanol
• Acétate de Sodium
• 2-Mercaptoethanol
• Acide Chlorhydrique
• Chloroforme
• Acide Acétique Glaciaire
• Phénol

Extrémités de Protocole

Références de Méthode