La préparation de protocole de Microarray de l'ADN fluorescente sonde du mRNA humain

La préparation de protocole de Microarray de l'ADN fluorescente sonde du mRNA humain

Fond sur le protocole - préparation des sondes fluorescentes d'ADN du mRNA humain

Étape 1 - Méthode de Préparation de Sonde de Microarray

1.  Étiquetez deux tubes Cy3 et Cy5 de microcentrifuge, respectivement.
2.  Combinez le suivant dans chaque tube pour recuire l'amorce : 2 μg de mRNA,  4 μg d'une amorce oligo-décollement régulière ou ancrée,  ajoutent ddH2O à un volume total de 10 μl.
3. La chaleur à 65°C pendant 10 minutes et se refroidissent sur la glace.
4. Ajoutez 10 μl du mélange suivant de réaction à chaque réaction Cy3 et Cy5 : 6.0 μl de mémoire tampon du brin 5X premier, 3.0 μl de 0.1 M DTT, 0.6 μl de dNTP non étiqueté, 1 millimètre Cy3 ou Cy5, 2.0 μl de l'exposant II
5. Incubez à 42°C pour 1 heure.
6.  Ajoutez 1 μl de SSII (propulseur renversé de transcriptase) à chaque échantillon.
7.  Incubez pendant une 0.5 à 1.0 heure supplémentaire.
8.  Ajoutez 15 μl de NacOh de 0.1 M pour dégrader l'ARN.
9.  Incubez à 70°C pendant 10 minutes.
10.  Ajoutez 15 μl de 0.1 M HCl pour neutraliser la réaction.
11.  Ajustez le volume sur 400 μl avec TE.
12.  Combinez les deux sondes dans 1 unité™ du filtrage Centricon-30.
13. Lavage # 1 : Centrifugeuse au krpm 14 dans un micro-concentrateur™ Centricon-30 pendant 7 minutes (voir le conseil # 1).
14.  Lavage # 2 : Ajoutez 45 μl de TE et les centrifugez encore au krpm 14 dans un micro-concentrateur™ Centricon-30 pendant 7 minutes.
15. Lavage # 3 : Ajoutez ce qui suit :
    450 μl de TE, de 20 μg d'ADN humaine du lit de camp 1, de 2 μl de 10 μg μl d'ARN de polyA, 2 μl de tRNA et  centrifugeuse à 14k T/MN dans un micro-concentrateur™ Centricon-30 pendant 7 minutes (voir le conseil # 2).
16. Concentrez à un volume de moins de 10 μl. Ce volume est atteint quand le centre de la membrane est sec et les formes de sonde une boucle de liquide aux bords de la membrane.
17.  Inversez le Centricon-30™ dans un tube et une centrifugeuse frais brièvement au krpm 14 pour récupérer la sonde.

Mémoires tampons pour la préparation de sonde de Microarray

20X SSC		3.0 NaCl de M 300 millimètres de citrate sodique (pH 8.0) 0.75 μl de 10% SDS
TE		10mM Tris EDTA de 1mM
tRNA		(Gibco-BRL, # 15401-011) 10 μgμl tRNA
ARN de PolyA		10 μgμl ARN de polyA (sigma, # P9403)
Mémoire tampon du Premier-Brin 5X		375 millimètres de KCl 250 millimètres Tris-HCl (pH 8.3) 15mM MgCl2
ADN Cot1 humaine		(Gibco-BRL)
DNTPs non étiquetés		10 millimètres de dTTP 25 millimètres de dGTP 25 millimètres de dATP 25 millimètres dCTP
Exposant II		200 unitésμl exposant II (Gibco-BRL)
1 millimètre Cy3 ou Cy5		(Amersham)
0.1 M DTT
Décollement ancré d'oligo		4 μgμl décollement d'oligo 5'-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTV N-3 '
Oligo-décollement		4 μgμl décollement d'oligo
SSII		Propulseur Renversé De Transcriptase

Extrémités et Conseils Étiquetants de Sonde De Microarray de Protocole