Protocoles de Synthèse d'ADN

Pour produire des "3'-fins que" l'ADN partielle copie, mRNA renversé-est transcrit à l'aide d'une amorce "hybride" (Qtotal, quart) qui se compose de deux bases mélangées (GATC/GAC a suivi près [ T]17) et un seul ordre de l'oligonucléotide 35-base (QI-QO).  L'amplification est alors exécuté en utilisant une partie contenante mieux habillée de cet ordre (Qouter, Qo) (qui lie maintenant à chaque ADN à ses 3'-fins) et une amorce dérivée du gène d'intérêt, GSP1 (amorce gène-spécifique 1). - [Amplification Lu d'ADN de 3'-Fins En utilisant Le Protocole Classique de RACE]

Produire de l'ADN partielle de "5'-fins" copie en utilisant RACE classique, les produits de premier-brin sont produits par la transcription renversée (extension mieux habillée) d'une amorce gène-spécifique connue (GSP-RT).  Puis, une queue de poly(A) est ajoutée en utilisant le deoxynucleotidyltransferase terminal (Tdt) et le dATP.  L'amplification est effectué à l'aide de trois amorces. - [Amplification Lu d'ADN de 5'-Fins En utilisant Le Protocole Classique de RACE]

Nouveau RACE, une variation de l'ARN ligase-mediated-RACE (RLM-RACE) (Liu et Gorovsky 1993) s'écarte de RACE classique (voir l'amplification d'ADN de 5'-Fins en utilisant RACE classique) parce qu'une amorce de "point d'attache" est attachée aux 5'-fins du mRNA avant l'étape renversée de transcription ; par conséquent l'ordre de point d'attache devient incorporé à l'ADN de premier-brin si, et seulement si, la transcription renversée procède par la longueur entière du mRNA d'intérêt. - [Amplification Lu d'ADN de 5'-Fins En utilisant Le Nouveau Protocole de RACE]

Une amorce d'oligodeoxynucleotide hybridée au mRNA est étendue par une polymérase ARN-DÉPENDANTE d'ADN pour créer une copie d'ADN qui peut être amplifiée par PCR.  Selon le but de l'expérience, l'amorce pour la synthèse d'ADN de premier-brin peut être spécifiquement conçue pour hybrider à un gène particulier de cible, ou une amorce générale telle que l'oligo(dT) peut être utilisée pour amorcer la synthèse d'ADN essentiellement de tous les mRNAs mammifères - [amplification lu de l'ADN produit par Reverse Transcription de protocole de mRNA]

Cette méthode, pour l'amplification sélectif des extrémités intégrales d'ADN, comporte l'ajout d'un adaptateur pendant la transcription renversée.  Cette méthode tire profit de la propension du transcriptase murin d'inverse de virus de leucémie de Moloney (MMLV droite) d'ajouter deux à quatre cytosines aux 3'-fins des brins nouvellement synthétisés d'ADN.  Les résidus supplémentaires sont ajoutés quand l'enzyme atteint la structure 5'-cap à l'extrémité du descripteur de mRNA. - [Protocole Lu de RACE de Chapeau-Commutation]

Ce système de synthèse d'ADN simplifie votre travail excessivement.  Tous les composants de réaction sont pré-mélangés et lyophylised.  Vous devez ajouter votre ARN et (pour les petits programmes Votre-Principaux) l'amorce.  Un autre avantage du système est un petit nombre d'étapes introduisantes à la pipette exigées, et a donc réduit le risque de contamination de RNase et de dégradation d'ARN. - [la première synthèse lue d'ADN de brin avec Prêt-À-Vont protocole de petits programmes]

Cette méthode de la première synthèse d'ADN de brin est plus efficace que Prêt-à-Vont des petits programmes.  Vous pouvez utiliser aussi peu que l'ARN 100ng total et vous détectez toujours expression de gène dans PCR. - [première synthèse lue d'ADN de brin avec le protocole superbe de séquence type II]

Dans MOPAC, les ordres d'aminé-terminal et de carboxy-terminal d'un peptide sont employés pour concevoir deux familles redondantes des oligonucléotides encodant les ordres de carboxy-terminal d'aminoand du peptide.  Les amorces sont utilisées pour amplifier un segment de l'ADN préparé par RT-PCR d'un tissu connu pour exprimer la protéine ou pour amplifier un segment de l'ADN d'une bibliothèque établie genomic ou d'ADN. - [amplification Oligonucléotide-amorcé mélangé lu de protocole d'ADN MOPAC]

Les réactions 3'-RACE sont employées pour isoler les ordres 3'inconnus ou pour tracer les termini 3'des mRNAs sur un ordre de gène.  3'-RACE exige la connaissance d'une petite région de l'ordre dans l'ARN de cible ou un clone partiel de l'ADN.  Une population des mRNAs est transcrite en ADN avec une adaptateur-amorce consistant à sa extrémité 3'd'une région de poly(T) et à sa fin 5'd'un ordre arbitraire de 30-40 nucléotides. - [l'amplification rapide lu 'ADN de 3 termine le protocole 3'-RACE]

Cette méthode est employée pour étendre l'ADN partielle copie en amplifiant les ordres 5'des mRNAs correspondants.  La technique exige la connaissance d'une petite région de l'ordre dans le clone partiel d'ADN.  Pendant le PCR, la polymérase thermostable d'ADN est dirigée vers l'ARN approprié de cible par une amorce simple dérivée de la région de l'ordre connu. - [l'amplification rapide lu 'ADN de 5 termine le protocole 5'-RACE]

Le protocole décrit la préparation des sondes soustraites d'ADN par l'hybridation à un gestionnaire de mRNA, suivie de la purification de l'ADN radioactive simple-échouée par la chromatographie de hydroxyapatite.  Avant de préparer la sonde, c'est une bonne idée d'avoir des filtres (qui contiennent la bibliothèque d'ADN à examiner) préparent pour hybrider. - [synthèse lue des sondes radioactives et soustraites d'ADN en utilisant Oligo(dT) comme protocole mieux habillé]