Immunoprécipitation des protocoles radioactifs de cellules

La méthode la plus puissante et la plus d'une façon convaincante pour déterminer si une protéine spécifique est phosphorylée d'une façon physiologique appropriée est d'analyser la phosphorylation in situ. Le procédé décrit implique d'incuber les cellules cultivées (par exemple, les cultures neuronales primaires ou les cellules transfected) ou les préparations de tissu (par exemple, parts hippocampal) de l'orthophosphate [32P], qui est alors pris par les cellules ou les tissus et incorporé à la position de γ-phosphate du triphosphate d'adénosine. - [Détection lue de phosphorylation de protéine dans les tissus et le protocole de cellules]

Coimmunoprecipitation est le plus utilisé généralement pour tester si deux protéines d'intérêt sont associées in vivo, mais il peut également être employé pour identifier les associés de interaction de roman d'une protéine de cible. Dans les deux cas, les cellules, qui ont pu avoir été étiquetées avec de la méthionine [35S], sont moissonnées et lysées dans les conditions qui préservent des interactions de protéine-protéine. La protéine de cible immunoprecipitated spécifiquement des extraits de cellules, et les immunoprecipitates sont fractionnés par SDS-PAGE. - [Identification lue des protéines associées par Coimmunoprecipitation Protocol]

Les cellules incorporent 35S-methionine ou cystéine pendant la synthèse de protéine. Ainsi il est essentiel au support rencontré et Cys-libre d'utilisation et a dialysé la FCS pendant l'écriture de labels. La période courte de l'incubation avec 35S-methionine ou cystéine aura comme conséquence radiolabeling (impulsion), et l'incubation supplémentaire avec la concentration excessive de Met+Cys non étiqueté (chasse) est nécessaire pour les glycoprotéines complexes comme des integrins pour obtenir exprimée comme une forme maturated. - [Protocoles métaboliques lus d'écriture de labels et d'immunoprécipitation]