2-D Électrophorèse bidimensionnelle de gel

L'électrophorèse de toutes les protéines cellulaires par un SDS-gel peut séparer des protéines ayant des différences relativement grandes dans le poids moléculaire cependant, il ne peut pas aisément résoudre des protéines ayant les poids semblables (par exemple une protéine 53-kDA d'une protéine 52-kDA).

Dans la méthode d'électrophorèse du gel 1D, les protéines sont séparées dans une dimension (qu'est à dire elles sont séparés par la masse seulement).

Dans la 2-D électrophorèse, la séparation commence par l'électrophorèse 1-D cependant il y a une deuxième séparation qui a lieu, séparant les protéines par la charge dans une direction 90 degrés dès la début.

Le résultat est que les analytes sont étendues à travers une surface bidimensionnelle plutôt que suivant une ligne. Ainsi, étant donné que des protéines sont séparées par non seulement de masse mais également par la charge, il est peu probable qu'il y aura plus d'une protéine à une donnée la tache sur le 2-D gel. C'est parce qu'il est peu probable que deux protéines partageraient non seulement la même masse exacte mais également la même chose charge.

Par conséquent, sur un 2-D gel, des analytes plus effectivement sont séparées dans la 2-D électrophorèse que dans l'électrophorèse 1-D due à la deuxième étape de séparation par la charge.

Afin de séparer des protéines d'une masse semblable, une autre caractéristique physique des protéines doit être employée. Une autre propriété physique importante de protéine qui peut être utilisée dans la séparation est la charge électrique, qui est déterminée par le nombre de résidus acides et de base dans une protéine et leur charge de groupe.

Deux protéines indépendantes ayant les masses semblables sont peu susceptibles d'avoir les frais nets identiques parce que leur ordre d'acide aminé serait différent, et ainsi la charge et le nombre de résidus acides et de base donneraient une charge nette différente. Ceci permettrait à ces protéines d'être séparées par 2-D, mais pas par l'électrophorèse du gel 1-D.

Dans la 2-D méthode de séparation de gel, des protéines sont séparées réellement par le point isoélectrique (le point isoélectrique (pi) est le pH auquel une molécule ou une surface particulière ne porte aucune charge électrique nette.).

Un gradient de pH est appliqué à un gel et un potentiel électrique est appliqué à travers le gel, rendant une extrémité plus positive que l'autre. À tout l'aother de pHs que leur point isoélectrique, des protéines seront chargées. Si elles sont franchement - chargé, elles seront tirées vers l'extrémité plus négative du gel et si elles sont négativement - chargé elles seront tirées à l'extrémité plus positive du gel. Une fois qu'elles atteignent la région du gel avec le pH correspondant à leur point isoélectrique, cependant, elles deviendront neutraly chargées et resteront dans cette tache.

Protocoles de détection de protéine pour l'électrophorèse bidimensionnelle

Après séparation, les protéines sont séparées dehors sur le 2-D gel, toutefois soyez invisible à l'oeil nu. Pour visualiser les protéines sur le gel, des méthodes très sensibles de souillure et de détection de protéines doivent être effectuées.

C'est dû à plusieurs faits :

1. Les ruelles de gel peuvent seulement recevoir un certain volume de lysate de cellules ou de solution de protéine.
2. Bien que le lysate/solution puisse être précipité et concentré pour charger plus de protéine, habituellement moins de protéine est chargée sur le 2D gel pendant que les montants excessifs de protéine le rendent difficile d'analyser le gel dû à de grandes tailles de tache.
3. La séparation d'un grand nombre de protéine (mgs), ou même les milliers de protéines différentes d'une petite ruelle, dans un gel relativement grand du dimensionsional deux produit des taches des protéines qui sont abudance/concentration très bas (NG ou picograms !) ce sont ou difficile pour détecter par les taches ordinaires ou les méthodes de détection de protéine.
4. Une basse abondance/bas protéine de nombre de copie peut être séparée, mais peut même ne pas être due détecté au fait que les taches les plus sensibles ont seulement une limite de détection environ d'un 1/2 un nanogram. Des niveaux de tache de Picogram il est impossible actuel très difficile ou à détecter avec la souillure.

Dans la 2D électrophorèse, des taches très sensibles sont donc exigées. Ces protéines peuvent alors être détectées par une série de moyens, mais le plus commun est tache de souillure et de coomasie d'argent.

2D gels de souillure argentés

Dans la souillure argentée du 2-D gel, un colloïde argenté est appliqué au gel. L'argent colle sur des groupes de cystéine dans la protéine. L'argent est alors obscurci par exposition à la lumière UV. L'obscurité de l'argent dans la tache, peut être liée à la quantité d'argent et donc à la quantité de protéine à un emplacement donné sur le gel. Cette mesure peut seulement donner des montants approximatifs, mais est adéquate pour la plupart des buts.

Souillure de Coomasie des 2D gels

Le colorant de Coomassie lie aux protéines par l'intermédiaire du physisorption aux acides aminés tels que les acides aminés, l'arginine, et l'histidine aromatiques. Coomasie est également utilisé dans la méthode de Bradford. On a produit des des taches non-toxiques sensibles de coomasie qui permettent la visualisation des taches contenant moins de 1 NG de protéine.

Souillure de SYPRO des 2D gels

Le RUBIS de SYPRO est une 2D tache très sensible de méthode de détection de protéine, permettant à visualisation environ de 1/2 par NG de protéine à une tache donnée. L'inconvénient est la méthode exige de la lumière UV de visualiser la tache, de ce fait exigeant l'utilisation d'une lumière UV. Ceci rend le découpage des taches en raison difficile et potentiellement dangereux de l'exposition UV possible.

Un protocole bidimensionnel d'électrophorèse de gel pour 7 cm IPG élimine la détection d'Amersham GE.

2D Préparation témoin de gel

• Les échantillons de protéine habituellement doivent être dessalés ou ont dialysé. La dialyse peut être conduite avec de grands sacs de dialyse pour de grands volumes, ou les mini glissent-un-lyzer (Pierce) pour de petits volumes.
• La dialyse a été conduite avec 1 L de 0.3mM que le bicarbonate d'ammonium plus de 30 minutes utilisant glissent-un-lyzer des kits de dialyse (Pierce).
• Après dialyse, des échantillons ont été lyophilisés utilisant un lyophilisateur pendant des heures de 1 ½.
• Des échantillons lyophilisés ont été alors reconstitués avec 400 l mémoire tampon de réhydration.

Mise au point isoélectrique d'IEF

Réhydration d'étape 1. des bandes d'IPG

• Le plateau isoelectrofocusing de réhydration de drystrip a été soigneusement nettoyé avec la solution de nettoyage d'IPGphor (Amersham GE sentant).
• Assurez-vous que le plateau est non humide sec, car l'échantillon sera executé le long des voies d'eau.
• Introduisez à la pipette 125 l sur la zone circulaire du plateau.
• Utilisant des brucelles, retirez soigneusement les bandes d'IPG du protecteur en plastique.
• Les bandes d'un certain IPG ont un coversheet en plastique ou éliminent protéger le côté de gel. Retirez ceci utilisant le forceps/brucelles avant d'utiliser ces bandes.
• Établissez doucement le côté de gel de bande vers le bas sur l'échantillon.
• Retirez toutes les bulles.
• Fixez sur l'extrémité de la ruelle de plateau d'huile minérale et assurez-vous vous poussée qu'elle avalent la ruelle jusqu'à ce qu'elle couvre complètement la bande d'IPG. Assurez-vous que les recouvrements d'huile minérale la bande de totalité comme ceci empêche l'évaporation pendant la réhydration fait un pas.