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Tache Occidentale

ACOUSTIQUE: Écoutez une explication occidentale détaillée de tache! Courtoisie : Institut de recherche de Recherche Humain National de Génome.

Définition Occidentale de Tache : Éponger occidental est une technique employée pour identifier et localiser des protéines basées sur leur capacité de lier aux anticorps spécifiques.

   L'analyse occidentale de tache peut détecter votre protéine d'intérêt d'un mélange d'un grand nombre de protéines.  Éponger occidental peut vous fournir des informations sur la taille de votre protéine (avec la comparaison à un repère ou une échelle de taille dans le kDa), et vous fournit également l'information sur l'expression de protéine (avec la comparaison à une commande telle que l'échantillon non traité ou un type ou un tissu différent de cellules). 

Sommaire : La tache occidentale vous fournit l'information sur :

Taille de votre protéine

Quantité d'expression de votre protéine

L'analyse occidentale de tache peut analyser n'importe quel échantillon de protéine si des cellules ou des tissus, mais également peut analyser les protéines de recombinaison synthétisées in vitro. La tache occidentale dépend de la qualité de l'anticorps que vous utilisez pour sonder pour votre protéine d'intérêt, et comment le détail il est pour cette protéine. Les anticorps sont maintenant facilement disponibles aux sources commerciales, et vous pouvez acheter un pour votre protéine d'intérêt. Si votre protéine est une protéine de roman, vous devez produire un anticorps vous-même ou obliger une compagnie à la faire pour vous. Dans ce cas-ci vous aurez besoin au moins d'un peu de votre protéine épurée des extraits de cellules ou faite en tant que de recombinaison (IE in vitro ou dans un système de recombinaison d'expression de protéine).   Les anticorps spécifiques à votre protéine sont essentiels à éponger occidental car ils peuvent lier spécifiquement à votre protéine d'intérêt au lieu des milliers de protéines sur votre tache occidentale !

Le schéma 1. Détails des étapes impliquées en obtenant la protéine pour la tache occidentale.

  Le schéma 2. Figure détailler les étapes en conduisant une tache occidentale.

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Comment Éponger Occidental Fonctionne-t-il ?

Voir le diagramme 1 ci-dessous. Premières choses première. Obtenez un échantillon de protéine que vous voulez analyser, comme des échantillons de cellules. Lysez les cellules pour libérer des teneurs en protéines. Exécutez ces derniers sur un gel qui sépare des protéines sur la base de la taille. Transférez alors ces protéines de gel sur une membrane en utilisant l'électricité. Cette membrane peut alors être utilisée pour sonder pour des protéines d'intérêt en utilisant un anticorps primaire.

Ce qui vous avez besoin de tache occidentale :

Un Échantillon de Protéine

Un bon anticorps pour détecter votre protéine d'intérêt

La tache occidentale se fonde sur l'anticorps primaire pour détecter cette protéine des milliers de protéines sur votre membrane et précédemment sur votre gel ! (une cellule peut contenir 30.000 protéines différentes - et ces mêmes protéines peuvent même être modifiées vous donnant plus de 300.000 protéines différentes !). L'utilisation d'un anticorps identifie votre anticorps primaire (un anticorps secondaire) que vous accumulez un sandwich à protéine-anticorps-anticorps !  L'anticorps secondaire a une enzyme de peroxydase de raifort sauvage qui convertit un substrat de luminol en substance libérante légère ! Cette lumière est détectée comme tache sur le film. À partir de cette tache vous pouvez déterminer combien protéine coûte là relativement à d'autres taches, ou la taille de la protéine relativement à un repère de taille qui est exécuté également sur le gel.

Le diagramme 2 montre un gel occidental d'exemple de tache. La ruelle 1 est une échelle de repère de taille de protéine qui montre différentes tailles connues des protéines, ceci peut être achetée commercialement et les tailles de toutes les taches sont indiquées dans une brochure. La ruelle 3 est un échantillon de cancer et la ruelle 5 est un échantillon normal. Comme vous pouvez voir la protéine dans la ruelle 3 a une expression plus élevée que l'échantillon de cancer dans la ruelle 5, qui est intéressante. En outre, les taches de protéine dans les ruelles 3 et 5 sont la même taille comme la 2ème tache dans l'échelle de taille de la ruelle 1. Nous pouvons alors regarder la taille connue de protéine de notre brochure que nous avons reçue avec l'échelle. Nous déterminons alors que la taille de la protéine est le kDa 80. Notre protéine d'intérêt est également le kDa 80. Ainsi nous savons que la tache occidentale a fonctionné et que la protéine est fortement exprimée en échantillon de cancer !

Pour détecter votre protéine :

Achetez un anticorps contre votre source primaire d'anticorps

Employez un ECL - kit et film de chemiluminescence pour obtenir les résultats

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Diagramme 1.                                                                                                                                      Diagramme 2.

Apprenez maintenant que tout autrement là est au sujet des taches occidentales !

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Table des matières, dans la commande faite pour la tache occidentale :

Étapes dans éponger occidental:

- se préparant à la tache occidentale

- qui anticorps à utiliser pour les taches occidentales

- lyser des cellules pour la tache occidentale

- l'Information de Gel de SDS-PAGE

- préparation de gel de SDS-PAGE pour les taches occidentales

- électrophorèse de gel - exécution du gel

- Tranfer des protéines à la membrane pour éponger occidental

- Tache Occidentale

Termes et définitions utilisés dans l'analyse occidentale de tache

Les Plus défunts Sujets Occidentaux de Tache!

 

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Étapes dans l'analyse occidentale de tache :

- Échantillon Prepartation

- Lyser La Mémoire tampon

- anticorps

- Lyser des Cellules

- Préparation de Gel

- Gel Fonctionnant

- transfert de gel

- commandes

- Tache Occidentale

- afficheur

- analyse et traduction

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Pour préparer des échantillons pour la tache occidentale :

Si vous avez les cellules Non-adhérentes (telles que des lignes de T-cellule ou des cellules de sang périphériques) ou les cellules adhérentes (telles que des cellules de fibroblaste ou des cellules de COS), vous devez enlever les protéines étrangères des medias. Pour les cellules non-adhérentes vous pouvez doucement les granuler avec la centrifugation et alors laver le granule avec PBS. Pour les cellules adhérentes, le lavage simple le flacon ou le plat avec PBS avant la tache occidentale.

 

L'analyse occidentale de tache examine des protéines, et ainsi nous voulons que les protéines soient version des cellules et empêchent également les protéines d'être coupé par des protéases. Nous avons besoin de ces derniers à la tache occidentale :

- pour maintenir des choses froides ! 4C sur la glace pendant le lysis de cellules pour éponger occidental

- employez le détergent pour casser vers le haut des membranes des cellules pour libérer des protéines

- mémoire tampon

- inhibiteurs (inhibiteurs de protéase et inhibiteurs de phosphatase si nous ferons la tache occidentale pour des phosphoprotéines)

 

Détersif - Lyser des Cellules Pour La Tache Occidentale

Le SDS et les RIPA sont des détergents qui sont employés pour solubiliser des protéines pour l'analyse postérieure en utilisant éponger occidental. Ceci est exigé autant de protéines sont à l'intérieur de la cellule ou des membranes intérieures localisées de cellules, ainsi nous devons libérer ces protéines pour pouvoir en mesure à l'immunoblot pour elles.

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Quel anticorps est-ce que je devrais utiliser pour éponger occidental ?

Vous devriez choisir un anticorps pour utiliser pour la tache occidentale. Habituellement des anticorps monoclonaux de souris ou les anticorps de polyclonal de lapin sont utilisés.

Vous pouvez utiliser ou un anticorps sans aucun groupe ajouté, ou utilisez un anticorps qui est conjugué à la biotine. Ces anticorps n'exigent pas

 

Polyclonal contre les anticorps monoclonaux pour la tache occidentale

Les anticorps monoclonaux sont habituellement meilleurs pour éponger occidental dû à :

- un meilleur taux de signal-bruit (fond inférieur dans la tache occidentale)

- leur spécificité plus élevée (vous obtenez moins de protéines ou d'Ig souillantes)

- résultats globaux de décapant sur le film épongeant occidental (bandes moins non spécifiques détectées)

 

Des anticorps de Polyclonal approprié mieux à l'immunoprécipitation :

- ils identifient plus d'epitopes

- ayez une avidité plus élevée

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Lyser des cellules pour la tache occidentale :

Les TIP avant vous lysent pour éponger occidental :

Si vous allez à la tache occidentale pour la masse de protéine (IE une protéine qui n'est pas phosphorylée) :

- vous pouvez lyser en plus grands volumes (gardant le repos pour éponger pour d'autres protéines)

 

Si vous allez à la tache occidentale une phosphoprotéine (ou protéine phosphorylée) il est important de faire ce qui suit :

- vous assurez vous des inhibiteurs de phosphatase d'utilisation (tels que le vanadate parce que les phosphatases élimineront les phosphates de vos protéines ! )

- lysez également les cellules en plus petit volume possible (l'IE lysent dans la mémoire tampon de chargement de l'UL 100, ceci est fait parce que vous pouvez charger la plupart des cellules que vous avez lysées. C'est tout important que le signal est tout à fait faible quand éponger occidental pour des phosphoprotéines.)

 

Si vous regardez des interactions de protéine-protéine:

- n'utilisez pas le SDS comme il dissocie des interactions de protéine-protéine et des protéines sont dénaturées ainsi (particulièrement après l'ébullition)

- pour des interactions épongeantes occidentales de protéine-protéine, interactions indigènes d'IE vous devez utiliser un détergent moins-rigoureux un tel RIPA.

 

Lyser :

- peut être fait directement du plat ou du plat

- granulez les cellules

- gardez sur la glace et le froid - utilisez une position de glace

- principe de base pour que combien mémoire tampon de lysis utilise coûte : cellules 10^5/uL de mémoire tampon de lysis

- rassemblez en tubes et étiquette d'eppendorf (gardez ces derniers sur la glace)

 

Mesurez la protéine totale avant analyse occidentale de tache :

- ceci permet une analyse plus quantitative si vous voulez comparer des conditions de traitement dans l'analyse occidentale de tache

- les kits commerciaux sont disponibles comme une analyse de Bradford pour mesurer la protéine totale (de Bio-Rad)

- 0.1% du SDS ou du plus grand bidon gênent la mesure de protéine

 

Dénaturez Les Échantillons de Protéine :

- ajoutez la mémoire tampon témoin de chargement de protéine à une partie aliquote de lysate de cellules - contient le colorant (voyez aussi le transfert sur un gel, 2% SDS)

- ajoutez l'agent réducteur du bisulfure tel que bêta - mercaptoéthanol

- ébullition dans le bloc de bain d'eau ou de chauffage (de plus basses températures telles que mi - 90 degrés diminuent l'agrégation de protéine).

- poussez un trou dans le chapeau de chaque tube pour empêcher sauter

 

L'information de gel de SDS-PAGE pour éponger occidental

Les gels de SDS-PAGE sont des matrices de gel qui sont employées pour séparer des protéines par taille en présence du courant électrique. Les bas gels de pourcentage séparent de plus grandes protéines tandis que de plus hauts gels de pourcentage séparent de plus petites protéines mieux. Le problème est que toutes les protéines ont chargé associé d'eux, et dans un courant électrique ceci pourrait poser des problèmes. Ceci est résolu par l'ajout du SDS aux échantillons de protéine. Le SDS lie aux protéines chaque quelques acides aminés et neutralise les différences de charge que les protéines ont. Ceci permet à des protéines d'être séparées par taille et pas par la charge.

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Préparation de gel de SDS-PAGE pour la tache occidentale

- selon combien de protéine vous voudrez charger pour éponger occidental, vous devriez utiliser de petits peignes ou plus grands peignes.

- le pourcentage de l'acrylamide est important. L'acrylamide habituellement de 10% est utilisé.

- un gel de résolution est utilisé au bas avec un pH de 8.8

- un gel d'empilement (4-5%) pH 6.8 est employé pour emballer des protéines dedans ensemble après chargement

- la polymérisation des gels est augmentée par les catalyseurs aps et TEMED qui accélèrent la réaction de polymérisation (formation et solidification) du gel de polyacrylamide.

- chargez chaque échantillon soigneusement et empêcher lentement l'échantillon fuyant hors de la ruelle.

- chargez chaque ruelle et utilisez la mémoire tampon témoin dans chacun (pour empêcher des différences dedans).

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Gélifiez l'Électrophorèse

1. Centrifugez les échantillons pour 10 sec après l'ébullition.
2. Chargez l'échantillon dans chaque ruelle
3. Chargez la référence de MW
4. Exécutez le gel à 100V (tension constante) ou même l'améliorez à 40 mA (courant constant). Observez la protéine marker/ladder ou teignez l'avant pour que le moment où arrête le gel. Le courant constant donne de meilleurs et plus marqués résultats si vous avez le temps.

- montre pour des bulles entre le verre et sous le gel - ceci signifie que cela fonctionne

- montre pour le transfert de protéine (devrait descendre) - si pas vous avez commuté les fils de sortie et pouvez détruire tous vos échantillons !

- exécutez au commencement lentement par le gel d'empilement (~ 50 volts), ceci donne des bandes plus pointues.

- n'exécutez pas durant la nuit

- ne surchauffez pas le gel (ceci fait détruire le gel la rigidité, menant aux pauvres resoloving et aux bandes mal formées troubles)

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Tranfer des protéines à la membrane pour éponger occidental

Choisissez Le Type de Membrane :

Peut utiliser l'un ou l'autre :

- membrane de PVDF pour les taches occidentales

- membrane de nitrocellulose pour les taches occidentales

- membrane en nylon (rarement utilisée maintenant - peut déchirer)

 

Extrémités pour Transfering à la membrane occidentale :

- gants d'usure à tout moment ! Utilisez le forceps

- réduisez au minimum touching/forceps à la membrane

 

Ordre de transfert Bio-Rad :

(-)
éponge sur le noir
papier filtre
nitrocellulose de gel
papier filtre
éponge
(+)

Transfert :

- maintenez frais dans 4C

- transfert durant la nuit à 35 V

- peut transférer rapidement en 1 heure à un V plus élevé

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Tache Occidentale

Le blocage des membranes vous permet de maximiser le taux de signal:noise

- gants d'usure

- bloc avec 5% Blotto (lait en poudre sans matières grasses - poudre) ou 1 - 5% BSA (albumine de sérum de boeuf) pour les protéines phosphorylées.

- la mémoire tampon est TBST

Lavage Après Blocage

- le lavage après blocage des étapes n'est pas critique, car bloc de personnes souvent pendant des incubations primaires d'anticorps.

- le lavage est habituellement fait avec la mémoire tampon de TBST. Peut être fait rapidement avec un grand volume de TBST.

Incubation avec de l'anticorps primaire

- souris, lapin ou d'autres espèces

- habituellement 1 : dilution 1000 avec TBST

- si les hautes bandes non spécifiques de background/many est un problème, des incubations peuvent être faites avec 5% BSA ou lait.

Lavage après anticorps primaire

- pas aussi critique

- peut laver rapidement avec de grands volumes de TBST

Incubation d'anticorps secondaire

- 1 habituellement dilué : 10. 000 avec TBST

- anti-souris, anti-lapin, ou tout autre anticorps conjugué avec de l'enzyme de HRP pour la détection

Lavage Après Anticorps Secondaire

- CRITIQUE

- lavage 5 X pendant 5 minutes avec TBST.

- si vous vraiment devez vous précipiter, laver au moins 3 fois avec de plus grands volumes de TBST.

Analyse pour des résultats

- habituellement ECL (chemiluminescence mise en valeur) est utilisé

- le film est exposé et développé. L'exposition pendant 10 secondes est assez habituellement pour la protéine totale. Les phosphoprotéines peuvent exiger 2 - 20 expositions minute.

- le film est habituellement XOMAT ou film 'rapide 'semblable

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Voir La Tache Occidentale De Dépannage

Termes utilisés dans éponger occidental :

WB - tache occidentale

IB - immunoblot (une autre limite pour éponger occidental)

SDS - Sulfate dodécylique de sodium (un détergent utilisé dans beaucoup de solutions épongeantes occidentales)

PAGE - Électrophorèse de Gel de Polyacrilamide

Ab - Anticorps (des anticorps sont employés pour détecter votre protéine d'intérêt)

HRP - Peroxydase de Raifort sauvage

Luminol - substrat que HRP se fend pour causer à formation légère

Ecl - Chemiluminescence mise en valeur (solution occidentale de tache à partir dont met en valeur la formation légère HRP + Luminol)

kD/kDa - kilodalton (la plupart de moyenne de protéines entre le kDa 30 - 80)

MÉMOIRE VIVE - anti-souris Ig de lapin

Isotype d'anticorps d'Ig - d'Immunoglobulin(an)

NP-40 - Nonidet P-40

PMSF - fluorure de phenylmethylsulfonyl

BSA - Albumine de Sérum de boeuf

NFDM - Lait en poudre sans matières grasses

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