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Taches Occidentales de Dépannage

  Le guide moléculaire de station des problèmes et des solutions épongeants occidentaux : Problèmes et solutions occidentaux communs de tache pour eux !

Veuillez nous contacter avec vos idées si vous pouvez ajouter à ce guide.

 

Quel est votre problème occidental de tache ? - Organisé Alphabétiquement

Bandes Brouillées

Bas Signal

La membrane rougeoie dans la salle foncée

Fond Élevé

Taches sur le film

Trop de bandes dans la tache occidentale

Signal Faible

 

 

Problème Occidental de Dépannage de Taches :

Taches sur le film (bandes manquantes) :

- transfert de pauvres dû aux bulles d'air pendant le transfert à la membrane

- film modifié en ajoutant au réalisateur

- les rouleaux de développement sont modifiés

Solution aux taches sur le film :

- utilisez une pipette de pasteur comme roulement de rouleau la membrane et le gel avant transfert pour enlever la membrane et les matériaux de subsistance de bulles humides.

- maintenez le film propre avant d'ajouter au réalisateur

 

Problème Occidental de Dépannage de Taches :

Trop de bandes dans la tache occidentale :

- habituellement en raison de beaucoup de bandes non spécifiques

- qualité primaire faible d'anticorps ou vieil anticorps

- pas assez bloquant

- fendage protéolytique d'antigène - toutes les bandes supplémentaires sont MW inférieur que votre protéine, (l'IE votre protéine est détecté mais a été dégradé)

Solutions à trop de bandes sur la tache occidentale :

- achetez un autre anticorps ou le substituez avec des actions fraîches d'anticorps

- bloc avec le lait sans matières grasses en poudre de 5% ou BSA avant d'ajouter primaire. Si vous bloquez déjà, considérez bloquer pendant des incubations primaires et secondaires d'anticorps et augmenter également en bloquant le lait ou la concentration de BSA.

- gardez tout sur la glace, utilisez les échantillons frais, entreposé dedans - 80C, et utilisez les inhibiteurs de protéase tels que PMSF

 

Problème Occidental de Dépannage de Taches :

Fond élevé ; bas taux de signal-bruit sur la tache occidentale

- noir ou chaque film foncé ; le film était trop long exposé

- le blocage était insuffisant ; la liaison non spécifique de l'anticorps primaire et les anticorps secondaires n'ont pas été lavés complètement

- le lavage était insuffisant

- le film rougeoie dans l'obscurité ! - dilutions secondaires ou primaires trop élevées

Solutions au film foncé :

- exposition pendant moins de temps, temps d'exposition de diminution

- augmentez bloquer la durée de l'incubation sèche sans matières grasses du lait 5% ou augmentez la concentration.

- également vous pouvez essayer de bloquer avec le sérum entier de l'animal de centre serveur avec (ou avant) de l'anticorps secondaire

- augmentez les périodes de lavage et les volumes à l'aide retirent n'importe quel signal non spécifique dû à l'attache faible d'anticorps.

- l'utilisation d'un détergent plus fort pour laver - au lieu de TBST (Tween-20), pour utiliser des détergents plus forts tels que NP-40 ou SDS qui peuvent fournir un lavage plus rigoureux et réduire le fond (font ceci seulement si vous vous réunissez est forte ! - le lavage également retire une certaine votre bande d'intérêt !)

- concentration secondaire très élevée en anticorps (ou même primaire) - exécutez les expériences d'optimisation pour déterminer des dilutions appropriées d'anticorps diluent les anticorps plus loin.

 

Problème Occidental de Dépannage de Taches :

Bas signal ou signal faible

- en raison de pas assez de protéine a chargé sur le gel

- l'anticorps primaire est vieux ou non bon

- les phosphoprotéines ont besoin habituellement de l'incubation primaire durant la nuit d'anticorps

- pas assez d'anticorps secondaire

- au-dessus-bloquant

- les réactifs se développants sont mauvais/vous ont fait une erreur en les préparant

Solutions au bas signal ou au signal faible:

- chargez plus d'échantillon de protéine sur le gel

- anticorps primaire frais d'essai

- incubez l'overnite primaire d'anticorps pour des phosphoprotéines à 4 degrés de C (dispositif trembleur de chambre froide)

- augmentez la concentration de la protéine (lysez les échantillons dans moins de mémoire tampon de lysis)

- diminuez la concentration de l'agent de blocage

- contrôlez les réactifs se développants ; préparez l'ECL frais et le re-ECL la membrane

- augmentez la concentration ou la durée la période primaire d'incubation d'anticorps

- augmentez la concentration ou la durée la période secondaire d'incubation d'anticorps

 

Bandes brouillées, bandes enduites, bandes non pointues

- en raison enduit par bandes du gel chaud

- en raison brouillé de bandes de la haute tension

Solutions aux bandes brouillées et aux bandes un-sharp :

- diminuez la tension ou actuel, exécutez dans la chambre froide, et préparez la nouvelle mémoire tampon courante (la chaleur fait détruire le gel sa rigidité et sa puissance de résolution)

- pré-imbibez la membrane de transfert dans la solution appropriée de transfert (déterminée par le constructeur de membrane) pour la durée requise.