Taches occidentales de dépannage

- Transfert de pauvres dû aux bulles d'air pendant le transfert à la membrane

- film modifié en ajoutant au réalisateur

- les rouleaux de développement sont modifiés

Solution aux taches sur le film :

- utilisez une pipette de pasteur comme rouleau. roulez la membrane et le gel avant transfert pour retirer des bulles. maintenez la membrane et les matériaux humides.

- maintenez le film propre avant d'ajouter au réalisateur

Problème occidental de dépannage de taches :

- habituellement en raison de beaucoup de bandes non spécifiques

- qualité primaire pauvre d'anticorps ou vieil anticorps

- pas assez bloquant

- fendage protéolytique d'antigène - toutes les bandes supplémentaires sont MW inférieur que votre protéine, (l'IE votre protéine est détecté mais a été dégradé)

Solutions à trop de bandes sur la tache occidentale :

- achetez un autre anticorps ou le remplacez par des actions fraîches d'anticorps

- bloc avec le lait sans matières grasses en poudre de 5% ou BSA avant d'ajouter primaire. Si vous bloquez déjà, envisagez de bloquer pendant des incubations primaires et secondaires d'anticorps et d'augmenter également en bloquant le lait ou la concentration de BSA.

- gardez tout sur la glace, utilisez les échantillons frais, entreposé dedans - 80C, et utilisez les inhibiteurs de protéase tels que PMSF

Problème occidental de dépannage de taches :

- noir ou chaque film foncé ; le film a été exposé trop longtemps

- le blocage était insuffisant ; la liaison non spécifique de l'anticorps primaire et les anticorps secondaires n'ont pas été lavés complètement

- le lavage était insuffisant

- le film rougeoie dans l'obscurité ! - dilutions secondaires ou primaires trop élevées

Solutions au film foncé :

- exposition pendant moins de temps, durée d'exposition de diminution

- augmentez bloquer la durée de l'incubation sans matières grasses du lait en poudre 5% ou augmentez la concentration.

- également vous pouvez essayer de bloquer avec le sérum entier de l'animal de serveur avec (ou avant) de l'anticorps secondaire

- augmentez les périodes et les volumes de lavage d'aider à retirer n'importe quel signal non spécifique dû à l'attache faible d'anticorps.

- utilisant un détergent plus fort laver - au lieu de TBST (Tween-20), utiliser des détergents plus forts tels que NP-40 ou SDS qui peuvent fournir un lavage plus rigoureux et réduire le fond (font ceci seulement si vous vous réunissez est fort ! - le lavage également retire une certaine votre bande d'intérêt !)

- concentration secondaire très élevée en anticorps (ou même primaire) - exécutez les expériences d'optimisation pour déterminer des dilutions appropriées d'anticorps. diluez les anticorps autres.

Problème occidental de dépannage de taches :

- en raison de pas assez de protéine a chargé sur le gel

- l'anticorps primaire est vieux ou non bon

- les phosphoprotéines ont besoin habituellement de l'incubation primaire durant la nuit d'anticorps

- pas assez d'anticorps secondaire

- au-dessus-bloquant

- les réactifs se développants sont mauvais/vous ont fait une erreur en les préparant

Solutions au bas signal ou au signal faible :

- chargez plus d'échantillon de protéine sur le gel

- anticorps primaire frais d'essai

- incubez l'overnite primaire d'anticorps pour des phosphoprotéines à 4 degrés de C (le dispositif trembleur de chambre froide)

- augmentez la concentration de la protéine (lysez les échantillons dans moins de mémoire tampon de lysis)

- diminuez la concentration de l'agent de blocage

- contrôlez les réactifs se développants ; préparez l'ECL et le re-ECL frais la membrane

- augmentez la concentration ou la durée de période d'incubation primaire d'anticorps

- augmentez la concentration ou la durée de période d'incubation secondaire d'anticorps

- en raison enduit par bandes du gel chaud

- en raison brouillé de bandes de la tension

Solutions aux bandes brouillées et aux bandes Un-sharp :

- diminuez la tension ou actuel, exécutez dans la chambre froide, et préparez la nouvelle mémoire tampon courante. (la chaleur fait détruire le gel sa rigidité et sa puissance de résolution)

- pré-imbibez la membrane de transfert dans la solution appropriée de transfert (déterminée par le constructeur de membrane) pour la durée requise.