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La chose importante en science n'est pas tellement d'obtenir de nouveaux faits quant à découvrent de nouvelles voies de penser à elles. ~William Laurent Bragg
Détermination de protéine par le protocole d'absorption de UV, (modifié du protocole par Alastair Aitken et Michèle P. Learmonth)
1. 0.1 M K2SO4 (pH 7.0).
2. solution tampon de phosphate de potassium de 5 millimètres,
pH 7.0.
3. Détergent non ionique (0.01% Brij 35)
4. Guanidinium-HCl.
5. filtre de millipore de 0.2-µm (Watford, R-U).
6. spectromètre UV-VISIBLE : La lampe d'hydrogène
devrait être choisie pour l'intensité maximum
à la longueur d'onde particulière.
7. Cuvets, quartz, pour < 215 nm.
1. Un spectrophotomètre fiable est nécessaire.
La solution de protéine doit être diluée dans
la mémoire tampon à une concentration qui est tout à
fait en conformité avec l'intervalle précis de l'instrument (voient
les notes 1 et 2).
2. La solution de protéine à mesurer peut être dans un éventail de mémoires tampons, ainsi ce n'est habituellement aucun problème pour trouver un qui est approprié pour la protéine qui peut déjà être dans une mémoire tampon particulière exigée pour une étape ou une analyse de purification pour l'activité enzymatique, par exemple (voir les notes 3 et 4).
3. Mesurez l'absorbance de la solution de protéine à 280 nm, en utilisant les cuvets de quartz ou les cuvets qui sont connus pour être transparents à cette longueur d'onde, remplis de volume de solution suffisamment pour couvrir l'ouverture par laquelle le faisceau lumineux passe.
4. La valeur obtenue dépendra de la longueur de
voie d'accès du cuvet. Si non 1 centimètre, il doit être
ajusté par le facteur approprié. La loi de
Bière-Lambert déclare cela : A (absorbance) = ε c
l où ε = coefficient d'extinction, c = concentration dans
mole/l et l = longueur de voie d'accès optique en centimètre.
Par conséquent, si ε est connu, la mesure de A
donne la concentration directement, ε est
normalement cité pour une longueur de voie d'accès
çentimètre.
5. La valeur réelle de l'absorbance UV pour une
protéine indiquée doit être déterminée par une certaine méthode
absolue, par exemple, calculée à partir de la composition en acides
aminés, qui peut être déterminée par analyse d'acide aminé.
L'absorbance UV pour une protéine est alors calculée selon la
formule suivante : A280 (1 mg/mL) = (5690nw + 1280ny + 120nc)/M
de là où le nanowatt, ny, et l'OR sont les nombres de
résidus de Trp, de Tyr, et de Cys dans le polypeptide
la masse M et 5690, 1280 et 120 sont les coefficients
respectifs d'extinction pour ces résidus (voir la note 5).
Voir également les protocoles de concentration en protéine d'autres laboratoires.
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