Immunoprécipitation

Des échantillons peuvent alors être lavés après précipitation et centrifugation. Les précipités peuvent alors être exécutés sur des gels de SDS-PAGE avec la mémoire tampon témoin de protéine. Habituellement les échantillons de protéine sont radioactifs avant le lysis de cellules. Ceci est fait en ajoutant habituellement les acides aminés radioactifs aux cellules. Ceci rend des choses simples pendant que la protéine alors est facilement détectée sur le film une fois exécutée sur un gel comme tache émettra le film de radioactivité et d'exposition. Vous pouvez alors évaluer pour la taille de la protéine (dans le poids moléculaire avec la comparaison pour classer des normes), et la quantité (en comparant les échantillons traités ou à un niveau des quantités).

D'ailleurs, le procédé d'immunoprécipitation permet également la concentration des protéines qui ne sont pas très abondantes ou difficiles à détecter utilisant la tache occidentale. L'IP peut concentrer des protéines jusqu'au fois 10.000 pendant qu'il peut prendre de grands volumes de lysates de cellules et concentrer votre protéine d'intérêt dans un petit précipité qui peut alors être utilisé pour l'analyse occidentale de tache ou d'autres méthodes.

Applications d'immunoprécipitation :

1) détermination du poids moléculaire et de la quantité de protéine immunoprecipitated par SDS-PAGE.

2) l'immunoprécipitation est employée pour évaluer pour des interactions de protéine-protéine. Ceci est fait immunoprécipitation pour une protéine, et puis en épongeant pour une autre protéine.

3) quantification de cadence de la synthèse d'une protéine en cellules en déterminant la protéine radioactive de quantité faite pendant un nombre de heures spécifique.

4) l'immunoprécipitation permet à la concentration des protéines il est autrement difficile détecter que.

La méthode d'immunoprécipitation peut être divisée en plusieurs étapes :

Selon l'application de l'immunoprécipitation ou de l'IP, vous voudrez utiliser différentes mémoires tampons de lysis.  Le choix de la mémoire tampon de lysis est important et dépend des caractéristiques de la protéine d'intérêt.

Si voulez étudier la phosphorylation des protéines ou des interactions de protéine-protéine, vous devriez essayer Np-40.

Si vous étudiez des niveaux de protéine totale d'une protéine, vous devriez essayer RIPA.

• Tris-HCL de 50 millimètres
• Ajustez sur pH 7.4
• 150 millimètres de NaCl
• 1 millimètre PMSF
• EDTA de 1 millimètre
• 5 µg/ml Aprotinin
• 5 µg/ml Leupeptin
• 1% Triton x-100
• Désoxycholate de sodium de 1%
• 0.1% SDS

• 50 millimètres de Tris-HCL de concentration de finale
• 150 millimètres de NaCl de concentration de finale
• Additionnez 1% NP-40
• Ajustez sur pH 8.0

L'étape preclear est habituellement faite pour l'immunoprécipitation parce qu'elle abaisse la quantité de protéines non spécifiques dans le lysate de cellules. En outre, le pré-effacement enlève également les protéines qui peuvent avoir des interactions non spécifiques possibles et une affinité élevée pour la protéine A, la protéine G, Immunoprecipitin, Zysorbin, ou les quelque forme insoluble de protéine obligatoire d'anticorps vous utilisez à déroulant votre anticorps. Quelques chercheurs trouvent cette étape inutile et sautent cette étape. Pré-effacement d'essai la première fois que vous essayez l'immunoprécipitation. Si vos résultats sont tout à fait clairs, essayez de sauter la prochaine expérience de pré-effacement et voyez comment elle s'avère.

Quel anticorps devriez-vous utiliser pour l'immunoprécipitation ? Des anticorps habituellement polyclonaux sont utilisés pour l'immunoprecipation.

Les complexes d'anticorps-antigène ne sont pas insolubles seuls, IE. l'immunoprécipitation, n'est pas une idée complète. Les anticorps et leur attache aux antigènes sont solubles dans le sang, mémoires tampons, et pendant l'expérience d'immunoprécipitation.  Ce qui est employé pour précipiter dehors ces complexes est les protéines obligatoires d'anticorps insoluble. Les protéines A et G, ont été isolées dans des bactéries, et le grippage à la région constante de l'anticorps.

Les exemples des protéines obligatoires d'anticorps insoluble employées pour précipiter des complexes dans l'immunoprécipitation sont :

• Protéine A
• Protéine G
• Zysorbin
• Immunoprecipitin

  Le lavage des complexes est fait utilisant RIPA, PBS, IP-lave la mémoire tampon, ou d'autres mémoires tampons selon ce que vous voudriez analyser après IP. La mémoire tampon de RIPA est plus rigoureuse tandis que PBS est moins rigoureux.

Recette de mémoire tampon de lavage d'IP

• 10mM Tris ; Ajustez sur pH 7.4
• EDTA de 1mM
• 1mM EGTA ; pH 8.0
• NaCl de 150mM
• 1% Triton X-100
• ortho--vanadate de sodium de 0.2mM
• cocktail d'inhibiteur de protéase

Notes finales pour l'immunoprécipitation

  Le succès d'immunoprécipitation dépend de l'affinité de l'anticorps pour son antigène.  Un bon anticorps d'immunoprécipitation te donnera le bas fond quand vous analysez les échantillons utilisant d'autres techniques après IP.  Les protéines anticorps-contraignantes insolubles utilisées sont également très importantes. Les anticorps polyclonaux sont les meilleurs anticorps pour utiliser cependant les anticorps monoclonaux purifiés peuvent également être utilisés.  Contrôlez votre constructeur d'anticorps pour voir si votre anticorps monoclonal était testé pour l'immunoprécipitation.

Extrémités pour l'immunoprécipitation

• Utilisez les tubes de 2 ml pour l'immunoprécipitation comme ils des précipités sont lavés et plus facilement resuspendus
• Essayez de sauter l'étape de pré-effacement pour épargner le temps
• Au lieu du lavage avec IP-lavez l'essai PBS de mémoire tampon
• Si vous avez déjà le bas fond et votre anticorps est grand, essayez l'IP lavant 2X au lieu de 5X
• Veillez-vous pour enlever autant liquide des tubes d'eppendorf quand lavage d'immunoprécipitation