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Immunoprécipitation et protocoles.
1. Traitez vos cellules
2. Moissonnez les cellules en ajoutant 500 uL de solubiliser la mémoire tampon, éraflez et traversez la seringue 21-gauge des temps de l'aiguille un X5 d'homogénéiser.
3. Conduisez une précipitation d'ACIDE TRICHLORACÉTIQUE (ceci sera employé pour normaliser si vous radioactif les cellules par exemple avec S-35)
4. Pré-effacement : Pré-clair en ajoutant 2 uL de X, souris ou lapin ou sérum de chèvre (où X est les espèces animales dans lesquelles l'anticorps primaire a été augmenté) aux échantillons entiers et incubez dans un rotateur pendant 30 minutes à la température ambiante.
5. Retirez le sérum de X par l'incubation avec l'immunoprecipitin de 30 uL avec la rotation de 30 minutes à la température ambiante.
6. Centrifugez les échantillons pendant 3 minutes à 13, 000 t/mn.
7. Après centrifugation, ajoutez 5 uL d'anticorps primaire (protéine spécifique anti-Y de X, où Y est l'anticorps augmenté dans un animal pour votre protéine d'intérêt) aux supernatants et incubez durant la nuit à 4 degrés de C.
8. Ajoutez 100 uL d'immunoprecipitin aux échantillons. Alternativement vous pouvez utiliser Zysorbin (Invitrogen). (Zysorbin exige quelques changements mineurs au protocole)
9. Centrifugeuse à 13, 000 t/mn pendant 3 minutes. Retirez le surnageant.
10. Lavez le granule 3 X avec 1 ml de mémoire tampon froide de lavage d'IP (ajoutez les inhibiteurs de protéase à la mémoire tampon de wah avant l'utilisation) avec la secousse pendant 5-10 minutes entre chaque lavage.
11. Employez ce granule pour exécuter sur un gel de SDS-PAGE. Vous pouvez ajouter la mémoire tampon témoin de SDS (mémoire tampon de chargement de protéine) au ce et le chargement sur le gel directement après l'ébullition.
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