Protocole d'immunoprécipitation

Immunoprécipitation et protocoles.

IP de base de protocole d'immunoprécipitation :

1. Traitez vos cellules

2. Moissonnez les cellules en ajoutant l'UL 500 de solubiliser la mémoire tampon, éraflez et traversez la seringue 21 fois de l'aiguille un X5 de mesure d'homogénéiser.

3. Conduisez une précipitation d'ACIDE TRICHLORACÉTIQUE (ceci sera employé pour normaliser si vous radioactif les cellules par exemple avec S-35)

4. Pré-effacement : Pré-clair en ajoutant l'UL 2 de X, souris ou lapin ou sérum de chèvre (où X est les espèces animales dans lesquelles l'anticorps primaire a été augmenté) aux échantillons entiers et incubez dans un rotateur pendant 30 minutes à la température ambiante.

5. Retirez le sérum de X par l'incubation avec l'immunoprecipitin de l'UL 30 avec la rotation de 30 minutes à la température ambiante.

6. Centrifugez les échantillons pendant 3 minutes à 13, 000 t/mn.

7. Après centrifugation, ajoutez l'UL 5 de l'anticorps primaire (anti-y protéine spécifique de X, où Y est l'anticorps augmenté chez un animal pour votre protéine d'intérêt) aux supernatants et incubez durant la nuit à 4 degrés de C.

8. Ajoutez l'UL 100 de l'immunoprecipitin aux échantillons. Alternativement vous pouvez utiliser Zysorbin (Invitrogen). (Zysorbin exige quelques modifications mineures au protocole)

9. Centrifugeuse à 13, 000 t/mn pendant 3 minutes. Retirez le surnageant.

10. Lavez le granule 3 X avec 1 ml de mémoire tampon froide de lavage d'IP (ajoutez les inhibiteurs de protéase à la mémoire tampon de wah avant l'utilisation) avec la secousse pendant 5-10 minutes entre chaque Washington.

11. Employez ce granule pour exécuter sur un gel de SDS-PAGE. Vous pouvez ajouter la mémoire tampon témoin de SDS (mémoire tampon de chargement de protéine) au ce et le chargement sur le gel directement après l'ébullition.