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Est la recherche ce que je fais quand je ne sais pas ce que je fais. Von Braun de ~Wernher
1. Réactif : Le réactif d'analyse est fait en dissolvant le magnésium 100 de Coomassie G250 bleu en 50 ml d'éthanol de 95%. La solution est alors mélangée à 100 ml d'acide phosphorique de 85% et composée à 1 L avec de l'eau distillée. Le réactif devrait être filtré à l'aide du papier filtre du numéro 1 de Whatman et être puis enregistré dans une bouteille ambre à la température ambiante. Il est stable pendant plusieurs semaines. Cependant, pendant ce temps le colorant peut précipiter de la solution et ainsi le réactif enregistré devrait être filtré avant l'emploi.
2. Norme de protéine. Bovin γ- la globuline à une concentration de 1 mg/mL (100 µg/mL pour la microanalyse) en eau distillée est utilisée comme solution courante. Ceci devrait être enregistré congelé –à 20oC. Puisque la teneur en humidité de la protéine pleine peut changer pendant la mémoire, la concentration précise de la protéine dans la solution étalon devrait être déterminée à partir de son absorbance à 280 nm. L'absorbance d'une 1 solution de mg/mL de γ- la globuline, dans une voie d'accès çentimètre légère, est 1.35. Les valeurs correspondantes pour deux normes de protéine, albumines de sérum de boeuf et ovalbumines alternatives, sont 0.66 et 0.75, respectivement.
3. Le plastique et la verrerie utilisés dans l'analyse devraient être absolument propres et détergent librement. Des cuvettes de spectrophotomètre de quartz (silice) ne devraient pas être utilisées, car le colorant lie à ce matériel. Des traces de la limite de colorant à la verrerie ou au plastique peuvent être retirées par le rinicage avec du méthanol ou la solution détersive.
1. Introduisez à la pipette entre le µg 10 et 100 de la protéine en volume total de 100 µL dans un tube à essai. Si la concentration approximative d'échantillon est inconnue, analysez un intervalle des dilutions (1, 1:10, 1:100, 1:1000). Préparez les doubles de chaque échantillon.
2. Pour la courbe d'étalonnage, introduisez à la pipette les volumes doubles 10, 20, 40, 60, 80, et 100 de µL de 1 mg/mL γ- solution étalon de globuline dans des tubes à essai, et faites à chacun jusqu'à 100 µL avec de l'eau distillée. Introduisez à la pipette le µL 100 de l'eau distillée dans un autre tube pour fournir le blanc de réactif.
3. Ajoutez 5 ml de réactif de protéine à chaque tube et mélangez bien par inversion ou adoucissez vortexmixing. Évitez d'écumer, qui mènera à la reproductibilité faible.
4. Mesurez l'A595 des échantillons et des normes par rapport au blanc de réactif entre 2 minutes et 1 h après mélange. La norme de 100 µg devrait donner une valeur A595 environ de 0.4. La courbe standard n'est pas linéaire, et l'absorbance précise change selon l'âge du réactif d'analyse. En conséquence, il est essentiel de construire une courbe d'étalonnage pour chaque ensemble d'analyses.
La méthode de microanalyse cette forme de l'analyse est plus sensible à la protéine. En conséquence, il est utile quand la quantité de la protéine inconnue est limitée (voir également la note 9). 1. Introduisez à la pipette les échantillons doubles contenant entre le µg 1 et 10 dans un volume total de µL 100 dans des tubes de microfuge du polyéthylène 1.5-mL. Si la concentration approximative d'échantillon est inconnue, analysez un intervalle des dilutions (1, 1:10, 1:100, 1:1000).
2. À la courbe d'étalonnage, introduisez à la pipette les volumes doubles 10, 20, 40, 60, 80, et 100 de µL de 100 µg/mL γ- solution étalon de globuline dans des tubes de microfuge, et ajustez le volume sur le µL 100 avec de l'eau. Introduisez à la pipette le µL 100 de l'eau distillée dans un tube pour le blanc de réactif.
3. Ajoutez 1 ml de réactif de protéine à chaque tube et mélangez doucement, mais complètement.
4. Mesurez l'absorbance de chaque échantillon entre 2 et 60 minutes après l'ajout du réactif de protéine. La valeur A595 d'un échantillon contenant le µg 10 γ- la globuline est 0.45.
voyez également : Analyse de Protéine de Bradford
Modifié du protocole par Nicholas J. Kruger.
Protocole de Concentration En Protéine
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