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Méthodes et analyse de détection de Microarray de protéine

Protéine et anticorps Microarrays

Méthodes et analyse de détection pour des puces de protéine et d'anticorps

Méthodes de détection et attache non spécifique
            L'attache non spécifique à l'alignement doit être réduite au minimum et ceci est typiquement fait en immergeant les alignements dans une mémoire tampon basée par albumine de sérum de boeuf (BSA) (31).
            Analyte-lier et conservation sur des alignements de protéine procède par l'intermédiaire du mécanisme de liaison thermodynamiquement piloté semblable à l'hybridation des cibles d'acide nucléique aux sondes.  Cependant, la détection des cibles attachées aux protéines est considérablement plus complexe que celle de la détection microarray d'ADN (9).  Actuel une variété de méthodes de détection sont examinées.  Par exemple, ELISA a été employé la première fois pour détecter des protéines pour des alignements de filtre (66.67) et des alignements en verre (68).  Les méthodes de détection basées par ELISA ont l'inconvénient de la non-spécificité des interactions de protéine-anticorps, menant à beaucoup de positifs faux.   Étiqueter de radio-isotope a été employé par Ge et autres. (22), radio-isotope étiquetant pour étudier la protéine–de protéine, ADN–de protéine, interactions–de drogue de protéine sur des alignements de filtre.  Zhu et autres. radio-isotope utilisé étiquetant pour conduire des analyses de kinase de différents substrats en utilisant les protéines épurées de kinase de levure sur un alignement (36).  La méthode préférée de détection est détection de fluorescence parce que ces méthodes sont généralement sûres, extrêmement sensible, simple et peut avoir très de haute résolution.  Ces méthodes de détection sont également compatibles avec les modules de balayage microarray standard. Généralement, une puce est l'une ou l'autre directement sondée avec une molécule fluorescente (par exemple une protéine fluorescently étiquetée ou une petite molécule, en utilisant une sonde étiquetée (par exemple biotine), qui peut alors être détectée dans une deuxième étape en utilisant un réactif fluorescently étiqueté d'affinité (par exemple streptavidin) (16.56). Une autre méthode étiquetante fluorescente est l'amplification de cercle de roulement (RCA), qui est également extrêmement sensible (32).  
            Bien que les proteomes sous la comparaison puissent être étiquetés d'une mode comparable avec des fluorophores, la reproductibilité de ces réactions chimiques est pauvre et interférence avec les présents d'interactions de protéine-anticorps une complexité supplémentaire (9). En outre, étiqueter non-uniforme des protéines peut être adressé en exécutant une analyse ratiometric de duel-couleur, où une norme interne est présente pour chaque protéine de cible qui est mesurée (9).          Un inconvénient des protéines étiquetantes avec des fluorophores est une réduction de l'exactitude quantitative de l'analyse, car l'incorporation de l'étiquette peut modifier les propriétés de liage des protéines (9).

Bien que des méthodes de détection étiquetantes de protéine directe encore soient largement répandues, les problèmes intrinsèques mentionnés a eu comme conséquence l'utilisation croissante des méthodes de détection d'étiquette librement pour des microarrays de protéine.  Ces méthodes sont spectrométrie de masse (MME.), microscopie atomique de force (AFM) (70), et résonance extérieure de plasmon (SPR) (71). 
les méthodes Non-étiquetantes ont des avantages comme approche directe de détection pour des microarrays d'anticorps puisqu'étiqueter des molécules affecte l'activité de protéine. La spectrométrie de masse de SELDI (laser surface-mis en valeur desorption/ionization) a été employée pour détecter les alignements à basse densité de protéines capturées (69). Des protéines sont capturées sur un alignement de surface en métal (alignement de protéine de SELDI) et sont vaporisées en utilisant un rayon laser.  L'analyse utilisant des données de spectrométrie de masse est alors exécutée afin d'indiquer les identités de ces protéines.

            Changements topologiques de force de la microscopie (AFM) de méthode de surface atomique d'utilisations pour identifier les protéines capturées sur un alignement d'anticorps (70).  Quand le lapin IgG est immobilisé sur une surface d'or et lie à ses anticorps élogieux, fourmi-lapin IgG, AFM de chèvre détecte l'augmentation de la taille, et peut ainsi mesurer lier des interactions.  Toutefois afin d'étudier la cinétique des interactions–d'anticorps d'antigène, des méthodes de détection en temps réel il sera utile.  La résonance extérieure de plasmon (SPR) a mûri dans un outil souple de détection pour étudier la cinétique des interactions–de ligand de récepteur avec un éventail des poids moléculaires, des affinités et des cadences obligatoires (72-74). Les puces commerciales de SPR sont disponibles cependant leur résolution de détection est limitée.  Une surface de capteur avec 64 différents sites d'immobilisation dans une cellule simple d'écoulement a été développée (75).  Un biodétecteur d'alignement d'anticorps a été également développé pour étudier la cinétique de l'antigène liant à l'aide d'un guide d'ondes plan comme méthode de détection. En utilisant cette méthode, le groupe a démontré que l'intensité significative de signal pourrait être réalisée des taches aussi petites que 200 millimètres de diamètre. On s'attend à ce donc que cette approche convienne au haut-débit et aux études parallèles de cinétique. (76).

Intervalle de détection
            Une autre différence entre la protéine et les microarrays d'ADN est que les concentrations en protéine en échantillon biologique simple ou cellules sont plusieurs commandes de magnitute plus grandes que cela pour des mRNAs.  Ainsi les systèmes de détecteur de puce de protéine doivent avoir un intervalle très étendu d'exécution de détection – jusqu'à un facteur de 1014, comparé à 104 pour le mRNA.  Ainsi un anticorps avec l'affinité nanomolar à une cible particulière sera saturé par la présence de cette cible aux concentrations micromolar et ne détectera pas les niveaux femtomolar de pico- ou de cible.  De ce fait faciliter les protéines rares et abondantes exigera probablement les alignements séparés (7.8.9).
            Des anticorps multiples avec des affinités variables pour la cible peuvent être placés à différentes zones des études d'alignement cependant ont prouvé que seulement 20% d'anticorps rangés fournissent des mesures des protéines aux basses concentrations (33). 

Ensuite : Production de protéine pour des alignements de protéine

Références pour la protéine et l'anticorps Microarrays

De nouveau à :

Introduction et fond aux puces de protéine et aux puces d'anticorps.

Types de puces d'anticorps et de protéine