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Méthodes et analyse de détection de Microarray de protéine

Microarrays de protéine et d'anticorps

Méthodes et analyse de détection pour des puces de protéine et d'anticorps

Méthodes de détection et attache non spécifique
            L'attache non spécifique à l'alignement doit être réduite au minimum et ceci est typiquement fait en immergeant les alignements dans une mémoire tampon basée par albumine de sérum de boeuf (BSA) (31).
            Analyte-lier et conservation sur des alignements de protéine procède par l'intermédiaire du mécanisme de liaison thermodynamiquement piloté semblable à l'hybridation des cibles d'acide nucléique aux sondes.  Cependant, la détection des cibles attachées aux protéines est considérablement plus complexe que celle de la détection de microarray d'ADN (9).  Actuel une série de méthodes de détection sont examinées.  Par exemple, ELISA a été employé la première fois pour détecter des protéines pour des alignements de filtre (66.67) et des alignements en verre (68).  Les méthodes de détection basées par ELISA ont l'inconvénient de la non-spécificité des interactions de protéine-anticorps, menant à beaucoup de positifs faux.   L'écriture de labels de radio-isotope a été employée par GE et autres (22), radio-isotope étiquetant pour étudier la protéine-protéine, protéine-ADN, interactions de protéine-drogue sur des alignements de filtre.  Zhu a et autres utilisé le radio-isotope étiquetant pour conduire des analyses de kinase de différents substrats en utilisant les protéines épurées de kinase de levure sur un alignement (36).  La méthode préférée de détection est détection de fluorescence parce que ces méthodes sont généralement sûres, extrêmement sensible, simple et peut avoir très la résolution.  Ces méthodes de détection sont également compatibles avec les modules de balayage standard de microarray. Généralement, une puce est l'une ou l'autre directement sondée avec une molécule fluorescente (par exemple une protéine fluorescent étiquetée ou une petite molécule, en utilisant une sonde étiquetée (par exemple biotine), qui peut alors être détectée dans une deuxième étape utilisant un réactif fluorescent étiqueté d'affinité (par exemple streptavidin) (16.56). Une autre méthode de écriture de labels fluorescente est l'amplification de cercle tournant (RCA), qui est également extrêmement sensible (32).  
            Bien que les proteomes sous la comparaison puissent être étiquetés d'une mode comparable avec des fluorophores, la reproductibilité de ces réactions chimiques est pauvre et interférence avec les présents d'interactions de protéine-anticorps une complexité supplémentaire (9). En outre, l'écriture de labels non-uniforme des protéines peut être adressée en exécutant une analyse quotientométrique de duel-couleur, où une norme interne est présente pour chaque protéine de cible qui est mesurée (9).          Un inconvénient des protéines de écriture de labels avec des fluorophores est une réduction de l'exactitude quantitative de l'analyse, car l'incorporation de l'étiquette peut modifier les propriétés de liage des protéines (9).

Bien que les méthodes de détection de écriture de labels de protéine directe soient encore employées couramment, les problèmes intrinsèques mentionnés a eu comme conséquence l'utilisation croissante des méthodes de détection d'étiquette librement pour des microarrays de protéine.  Ces méthodes sont la spectrométrie de masse (milliseconde), la microscopie atomique de force (AFM) (70), et la résonance extérieure de plasmon (SPR) (71). 
les méthodes de Non-écriture de labels ont des avantages comme approche directe de détection pour des microarrays d'anticorps puisque l'écriture de labels des molécules affecte l'activité de protéine. La spectrométrie de masse de SELDI (désorption surface-améliorée/ionisation de laser) a été employée pour détecter les alignements à basse densité de protéines saisies (69). Des protéines sont saisies sur un alignement de surface en métal (alignement de protéine de SELDI) et sont vaporisées utilisant un à rayon laser.  L'analyse utilisant des données de spectrométrie de masse est alors exécutée afin d'indiquer les identités de ces protéines.

            Modifications topologiques de force de la microscopie (AFM) de méthode de surface atomique d'utilisations pour identifier les protéines saisies sur un alignement d'anticorps (70).  Quand le lapin IgG est immobilisé sur une surface d'or et lie à ses anticorps élogieux, fourmi-lapin IgG, AFM de chèvre détecte l'augmentation de la taille, et peut ainsi mesurer lier des interactions.  Toutefois afin d'étudier la cinétique des interactions d'antigène-anticorps, des méthodes de détection en temps réel il sera utile.  La résonance extérieure de plasmon (SPR) a mûri dans un outil souple de détection pour étudier la cinétique des interactions de récepteur-ligand avec un éventail des poids moléculaires, des affinités et des cadences obligatoires (72-74). Les puces commerciales de SPR sont disponibles cependant leur résolution de détection est limitée.  Une surface de capteur avec 64 différents sites d'immobilisation dans une cellule à courant simple a été développée (75).  Un biodétecteur d'alignement d'anticorps a été également développé pour étudier la cinétique de l'antigène liant utilisant un guide d'ondes plan comme méthode de détection. Suivre cette méthode, le groupe a expliqué que l'intensité significative de signal pourrait être réalisée des taches aussi petites que 200 millimètres de diamètre. On s'attend à ce donc que cette approche convienne au haut-débit et aux études parallèles de cinétique. (76).

Portée de détection
            Une autre différence entre la protéine et les microarrays d'ADN est que les concentrations en protéine en échantillon biologique simple ou cellules sont plusieurs commandes de magnitute plus grandes que celle pour des mRNAs.  Ainsi les systèmes de détecteur de puce de protéine doivent avoir une portée de détection très étendue l'exécution - jusqu'à un facteur de 1014, comparé à 104 pour l'ADN messagère.  Ainsi un anticorps avec l'affinité nanomolar à une cible particulière sera saturé par la présence de cette cible aux concentrations micromolar et ne détectera pas les niveaux femtomolar de pico- ou de cible.  De ce fait faciliter les protéines rares et abondantes exigera probablement les alignements séparés (7.8.9).
            Des anticorps multiples avec des affinités variables pour la cible peuvent être placés à différentes zones des études d'alignement cependant ont prouvé que seulement 20% d'anticorps rangés fournissent des mesures des protéines aux basses concentrations (33). 

Ensuite : Production de protéine pour des alignements de protéine

Références pour des Microarrays de protéine et d'anticorps

De nouveau à :

Introduction et fond aux puces de protéine et aux puces d'anticorps.

Types de puces d'anticorps et de protéine

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