États réussis d'ACP

Paramètres pour l'ACP réussi

Êtes-vous eu des problèmes de réaliser un ACP réussi ?  Beaucoup de facteurs peuvent affecter vos résultats de votre ACP comme : Cofacteurs d'ion en métal, substrat et analogues de substrat, mémoires tampons et sels et Cosolvents.  Considérations de mise en chauffage en outre :  Navires d'ACP, optimisation de la température et de temps, cycles d'amplification d'ACP, enzyme/cible et début chaud. 

Cofacteurs d'ion en métal et ACP

Un cofacteur essentiel pour l'ADN polymérase Dans l'ACP est chlorure de magnésium.  Sa concentration doit être optimalisée pour chaque amorce : système de descripteur. Beaucoup de composants de l'ion de magnésium de grippage de réaction, y compris les amorces, le descripteur, les produits d'ACP et les dNTPs. Le lieur de 1:1 principal pour l'ion de magnésium est la concentration élevée des dNTPs dans la réaction. Puisqu'il est que l'ion libre de magnésium serve de cofacteur d'enzymes dans l'ACP, toute la concentration en ion de magnésium doit dépasser toute la concentration de dNTP. Typiquement, pour commencer le processus d'optimisation, 1.5 millimètre de chlorure de magnésium est ajouté à l'ACP en présence des dNTPs totaux de 0.8 millimètre. Ceci laisse environ 0.7 millimètre de magnésium libre pour l'ADN polymérase. Généralement l'ion de magnésium devrait être varié d'une série de concentration de 1.5-4.0 millimètre dans des étapes de 0.5 millimètre.

Substrats et analogues de substrat pour l'ACP

Les ADN polymérases Incorporent très efficacement des dNTPs.  Ils peuvent également incorporer les substrats modifiés, quand ils sont utilisés en tant que composants supplémentaires dans l'ACP. Les exemples des substrats utilisés pour l'ADN polymérase Sont : Digoxigenin-dUTP, biotin-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP, et dNTPs fluorescent étiquetés. Pour l'ACP conventionnel, la concentration des dNTPs demeure équilibrée dans des taux équimolaires, par exemple, le μM 200 chaque dNTP. Notez également cela, déviations de ces recommandations standard peut être salutaire dans certains amplications. Par exemple, quand la mutagénèse aléatoire d'une cible spécifique est désirée, les concentrations non équilibrées de dNTP favorisent un degré plus élevé de misincorporations par l'ADN polymérase.

Mémoires tampons et sels pour l'ACP

Selon l'ADN polymérase A utilisé la concentration optimale de mémoire tampon d'ACP, concentration en sel, et le pH devrait être sélectionné en conséquence à l'ADN polymérase. La mémoire tampon d'ACP pour l'ADN polymérase de Taq se compose de 50 millimètres de KCl et de Tris-HCL de 10 millimètres, pH 8.3, à la température ambiante. Cette mémoire tampon fournit la concentration ionique et le pouvoir tampon requis pendant la réaction. Il est important de noter que la concentration en sel affecte le TM de l'amorce : duplex de descripteur, et par conséquent la température de recuit.

Cosolvents

L'ACP différent Cosolvents sont employés pour augmenter le rendement, l'efficacité, et la spécificité des amplifications d'ACP. Ces cosolvents peuvent être avantageux dans quelques amplifications, et désavantageux dans d'autres amplifications. Il est impossible de prévoir quel additif sera utile pour chaque amorce : le duplex de descripteur et donc le cosolvent doit être empiriquement testé pour chaque combinaison.

Considérations de mise en chauffage

Navires d'ACP

L'ACP doit être effectué dans des navires qui sont compatibles avec de basses quantités d'enzyme et d'acides nucléiques et qui ont de bonnes caractéristiques de transfert thermiques. Habituellement, le polypropylène est utilisé pour des navires d'ACP et des tubes conventionnels et à parois épaisses de microcentrifuge sont choisis pour beaucoup de systèmes thermiques de cycler. L'ACP le plus souvent est effectué à une échelle de réaction du μL 10-100 et exige la prévention des processus d'évaporation/condensation dans le tube fermé de réaction pendant la mise en chauffage. Une couche d'huile minérale de recouvrement ou de cire atteint cet objectif. Plus récemment, les navires 0.2-mL à parois minces ont été optimalisés pour le processus d'ACP et des cyclers thermiques exempts d'huile ont été conçus qui utilisent une couverture heated au-dessus des tubes tenus dans le bloc témoin.

Optimisation de durée de cycle de la température et

Il est essentiel que les mélanges de la réaction atteignent la dénaturation, le recuit, et les températures d'extension dans chaque cycle thermique. Si le temps de prise insuffisant est spécifié à n'importe quelle température, la température de l'échantillon ne sera pas équilibrée avec celle du bloc témoin. Un certain cycler thermique conçoit le temps où l'intervalle de prise a basé sur la température de bloc, tandis que d'autres basent le temps de prise sur la température prévue d'échantillon. Si un tube à parois épaisses conventionnel utilisé dans un cycler contrôlé par la température de bloc, un temps de prise de 60 s est suffisant pour l'équilibration. Le temps extra peut être recommandé au (72°C) étape d'extension pour de plus longs produits d'ACP. Utilisant un tube 0.2-mL à parois minces dans un cycler contrôlé par la température prévue d'échantillon, seulement 15 s est exigés. Pour utiliser des protocoles existants ou aux protocoles de développement pour l'usage aux laboratoires multiples, il est très important de choisir des temps de prise selon l'épaisseur de paroi de conception et de tube de cycler.

Nombre de cycle d'amplification d'ACP

Le nombre de cycles d'amplification d'ACP devrait être optimalisé en ce qui concerne la concentration commençante de l'ADN de cible. On lui recommande que, de 40 - 45 cycles pour amplifier 50 molécules de cible, et 25-30 fait un cycle pour amplifier 3 molécules du × 105 à la même concentration. Cette non-proportionnalité est provoquée par un soi-disant effet de plateau, dans lequel une diminution de la cadence exponentielle de l'accumulation de produit se produit aux étapes tardives d'un ACP. Ceci peut être provoqué par la dégradation des réactifs (dNTPs, enzyme) ; épuisement de réactif (amorces, dNTPs) ; inhibition de produit final (formation de pyrophosphate) ; concurrence pour des réactifs par les produits non spécifiques ; ou concurrence pour l'amorce liant par reannealing (10 nanomètre) du produit concentré. Il est habituellement recommandé d'exécuter le nombre minimum de cycles requis pour voir le produit spécifique désiré, parce que les produits non spécifiques non désirés s'y mêleront si le nombre de cycles est excessif.

 Enzyme/cible

Dans une partie aliquote standard de l'ADN polymérase de Taq utilisé pour une réaction de 100 μL, il y a environ 1010 molécules. Chaque échantillon d'ACP devrait être évalué pour le nombre de copies de cible qu'il contient ou peut contenir. Par exemple, 1 NG d'ADN de lambda contient 1.8 copie du × 107. Pour l'ACP de nombre de copie de bas-entrée, l'enzyme devient limitante et il peut être nécessaire de donner au processus d'extension incrémentalement plus de temps. Les cyclers thermiques peuvent sûrement exécuter ce procédé automatique d'extension de segment afin de maximiser le rendement d'ACP.

États de début chaud

Toutes les optimisations ci-dessus s'appliquent également à un ACP qui est conçu, du début, avec une méthode de début chaud. Souvent, un début chaud peut être incorporé avec succès à un ACP précédemment optimalisé sans changer les conditions de réaction. Cependant, il paye habituellement pour reoptimize après avoir ajouté un début chaud. L'optimisation est souvent un équilibre entre fabriquer autant produit comme possible et surproduire non spécifique, amplifications de fond. Puisque le début chaud réduit considérablement des amplifications de fond, les recyclages supérieurs sont augmentés sur des conditions telles que la concentration en enzymes, le nombre de cycle, et la concentration en cofacteur d'ion en métal. PCRs sensible qui ont été fortement accordés sans début chaud peut échouer quand un début chaud est ajouté. Ceci peut être provoqué par de légers retards dans de premiers cycles provoqués par le mélange ou le lancement d'enzymes. L'ACP habituellement peut être restauré, souvent avec l'augmentation substantielle du produit spécifique, en augmentant simplement limitant des paramètres ou des réactifs. En outre, il y a des optimisations spécifiques à chaque méthode de début chaud. Le mélange ou le lancement d'enzymes peut être affecté par le volume d'ACP, la composition en mémoire tampon et le pH, cosolvents, conditions de recyclage, et ainsi de suite. La littérature du produit spécifique, souvent une insertion de produit, devrait être consultée pour l'information sur ces considérations.