Mutagénèse dirigée par site basée par ACP

Mutagénèse de site d'amplification en chaîne par réaction

Renseignez-vous sur la mutagénèse dirigée par site basée par ACP.

(Référez-vous au diagramme ci-dessous)

Commencez d'abord par un plasmide contenant un gène avec un codon de tyrosine de TAC que nous voulons modifier à un codon de phénylalanine de TTC. Afin d'accomplir ceci que nous devons changer aux paires (bleues) dans l'original en paire de T-A. Ce plasmide a été isolé dans une contrainte normale d'Escherichia coli qui méthyle en date des ordres de GATC. Les groupes méthyliques sont indiqués en jaune. Les étapes suivantes sont exécutées pour accomplir ceci :

Chauffez le plasmide pour séparer ses brins.
Nous recuisons alors les amorces mutagéniques qui contiennent le codon de TTC, ou son complément renversé, GAA. La base modifiée dans chaque amorce est indiquée dans le rose.
Nous exécutons alors quelques ronds d'ACP (environ 8) avec les amorces mutagéniques pour amplifier le plasmide avec le codon modifié. Nous employons un ADN polymérase Thermostable, tel que la polymérase de Pfu, pour réduire au minimum des erreurs en copiant le plasmide.
Nous préparons alors l'ADN dans la réaction d'ACP avec DpnI pour assimiler le sauvage-type méthylé ADN. Puisque le produit d'ACP a été rendu in vitro, il n'est pas méthylé et n'est pas coupé. Pour finir nous transformons des cellules d'Escherichia coli avec de l'ADN préparée. En principe, seulement l'ADN mutée survit pour transformer. Ceci est contrôlé en séquençant l'ADN de plasmide de plusieurs clones.

Mutagénèse dirigée par site

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