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Polymérases de PCR

Choisissant la polymérase droite d'ADN est déterminé par les objectifs de l'expérience. Il y a une vaste quantité d'anzymes disponibles dans le commerce à choisir du ce diffèrent dans leur processivity, stabilité thermique et fidélité. L'enzyme la plus commune utilisée est polymérase d'ADN de Taq également connue sous le nom de commercialement que, polymérase® d'ADN d'AmpliTaq.

Polymérase d'ADN d'AmpliTaq

La polymérase d'ADN d'AmpliTaq est une enzyme de recombinaison fortement caractérisée pour PCR. Produit dans E. coli à partir du gène de polymérase d'ADN de Taq, de ce fait assurant la grande pureté. Elle est généralement fournie et utilisée comme 5 uμL solution en glycérol protégé de 50% (v/v).

Properities Physique : L'enzyme est une protéine du kDa 94 avec une activité’de la polymérisation’ 5 -3 qui est la plus efficace dans l'intervalle–de 70° 80°C. Elle est incroyablement thermostable, avec une demi vie à 95°C de 35–40 minutes. En termes de cycle thermique, la demi vie est approximativement 100 cycles. Les produits de PCR utilisant cette enzyme auront des surplombs de base simples sur les 3’ extrémités de chaque brin polymérisé (ceci peut être exploité pour l'usage avec des vecteurs de clonage de T/A).

Bio Réactions : La polymérase d'ADN exige l'ion de magnésium comme cofacteur et catalyse la réaction d'extension d'un descripteur amorcé à 72°C. Les quatre dNTPs sont employés pour étendre l'amorce et therby pour copier l'ordre de cible. Des nucléotides en outre modifiés peuvent être incorporés aux produits de PCR.

Activités : Cette enzyme a a fourchette-comme la personne à charge de structure, polymérisation mise en valeur, activité’de la nucléase’ 5 -3. L'activité qu'elle possède la permet que le Ti dégradent les amorces descendant et ont indiqué que des cibles de circuka devraient être linéarisées avant amplification. En outre cette activité de nucléase a été utilisée dans une technique signal-produisante fluorescente pour la quantitation de PCR. Cette enzyme n'a pas un exonuclease 3’-5’ inhérent ou activité de corriger, mais produit des amplicons de rendement élevé pour la plupart des applications.

Polymérase d'Or d'AmpliTaq

Cette enzyme est une polymérase chimiquement modifiée d'ADN d'AmpliTaq, les subsistances réversibles de modification l'enzyme inactive à la température ambiante. Le pH à hautes températures et bas favorisent l'inversion, restaurant l'activité enzymatique. Ces conditions se produisent dans un PCR Tris-protégé à 92°–95°C (le Tris-Cl formulé à pH 8.3 à 25°C relâche au-dessous de pH 7.0 90°C ci-dessus). De l'or d'AmpliTaq est formulé pour exécuter les mêmes que 5 uμL polymérase d'ADN d'AmpliTaq. Par conséquent, un début chaud peut être ajouté à la plupart des PCRs optimalisé avec de la polymérase d'ADN d'AmpliTaq en substituant l'or d'AmpliTaq et en ajoutant 10minute, 95°C, pre-PCR, étape de lancement.

Les mêmes résultats peuvent être réalisés sans étape de lancement de pre-PCR en ajoutant 10 supplémentaires cycles ou plus de PCR. Dans ces conditions, l'enzyme est lancée incrémentalement pendant les étapes de dénaturation de PCR.

Voir également les polymérases de PCR un excellent article à la station de PCR.