Bioinformatics, Protocoles, Protéine Proteomics d'ARN d'ADN
à la maison > pcr > histoire-de -pcr > index.php
à la maison > pcr > histoire-de -pcr > index.php
 |
|---|
 |
 |
 |
 |
 |
|
|---|---|---|---|---|---|
Protocoles de PCR
|
PCR Bioinformatics et bases de données |
Renseignez-vous sur PCR |
Kits et produits de PCR |
Forum de PCR |
Livres de PCR
|
En outre station de la visite PCR
Copyright MolecularStation 2006
Réaction en chaîne de Polymérase - PCR
Table des matières:
Introduction à PCR - réaction en chaîne de polymérase
Réaction en chaîne de Polymérase (PCR)
Spécificité et efficacité de Polymerases/Reaction
Misincorporation : Erreurs des systèmes in vitro
PCR sera-t-il jamais substitué ? – Amplification Helicase-dépendant (HDA)
Il y a plus de 30 ans, l'introduction de la technologie de recombinaison de lc'adn Comme un outil pour les sciences biologiques a révolutionné l'étude de la vie. Le clonage moléculaire a permis l'étude de différents gènes de matière organique ; cependant cette technique dépendait d'obtenir une quantité relativement grande d'ADN pure. Ceci a dépendu de la réplique de l'ADN des plasmides ou d'autres vecteurs pendant la division de cellules des micro-organismes (1). Les chercheurs l'ont trouvé extrêmement laborieux et difficile d'obtenir une ADN spécifique dans la quantité de la masse des gènes dans un échantillon biologique (2). La technologie de recombinaison de lc'adn A rendu la première analyse moléculaire possible et le diagnostic prénatal de plusieurs maladies humaines. L'ADN foetale obtenue par le prélèvement d'amniocentèse a pu être analysée par digestion d'enzymes de restriction, électrophorèse, transfert méridional et hybridation à un gène copié ou aux sondes d'oligonucléotide (3). Cependant, éponger méridional a permis seulement tracer rudimentaire des gènes dans les individus indépendants (4).
PCR, un acronyme pour la réaction en chaîne de
polymérase (5.6), a permis la production de grandes quantités d'une
ADN spécifique d'un descripteur complexe d'ADN dans une réaction
enzymatique simple. PCR est un procédé récemment
développé pour l'amplification in vitro de l'ADN. PCR a transformé
la manière dont presque tout étudie exiger la manipulation des
fragments d'ADN peut être exécuté par suite de sa simplicité et
utilité (7).
Dans les années 80, Kary Mullis (le schéma 1) et une équipe
des chercheurs à Cetus Corporation à Cetus Corporation conçue d'une
voie de commencer et arrêter l'action d'une polymérase aux points
spécifiques le long d'un brin simple de l'ADN. Mullis
s'est également rendu compte qu'en armant ce composant de technologie
moléculaire de reproduction, l'ADN de cible pourrait être
exponentiellement amplifiée. Ce procédé
d'amplification d'ADN a été basé sur un processus in vitro plutôt
qu'in vivo (5.6.8). L'amplification sans cellule d'ADN
par PCR pouvait simplifier plusieurs des procédures standard pour le
clonage, analysant, et d'acides nucléiques de modification (1). Les techniques précédentes pour isoler un morceau
spécifique d'ADN se sont fondées sur le gène copiant – un procédé pénible et lent. PCR,
d'autre part kerry Mullis indiqué “vous laisse
sélectionner le morceau d'ADN vous’au sujet
d'intéressé dedans et avoir autant pendant que vous voulez” (2.8). Quand d'autres scientifiques de
Cetus ont par la suite réussi à faire à la polymérase la réaction
en chaîne exécutez comme désiré d'une mode fiable, ils ont eu une
technique immensément puissante pour fournir essentiellement des
quantités illimitées des biologistes moléculaires matériels génétiques précis et de
d'autres priés pour leur travail (8). Depuis le premier
état in1985, plus de 5000 papiers scientifiques ont été édités
d'ici 1992 (1). En outre, le grand nombre de
publications naturellement le rend impossible de passer en revue
toutes les contributions importantes au développement et à
l'application de la technologie de PCR ; cependant nous
essayerons de passer en revue ici les développements les plus
importants dans la pratique de PCR de base.
On a pensé PCR pour être conçu par Dr. Kerry
Mullis dans 1983 tout en travaillant à Cetus Corporation dans
Emeryville, CA. Cependant, un certain travail pilote a
été également effectué par Gobind Khorana en 1971 qui a décrit un
principe de base de replier un morceau d'ADN à l'aide de deux
amorces. Le progrès alors a été limité par les
issues mieux habillées de purification de synthèse et de polymérase
(9). Dans la tête’de Mullis s,
l'invention s'est développée d'un arrangement théorique pour
exécuter l'ordonnancement limité de dideoxynucleotide de seuls
gènes humains en utilisant les oligonucléotides synthétiques afin
des mutations humaines communes de diagnostic de la maladie. Un obstacle évident à une stratégie d'ordonnancement
si directe était la complexité élevée des paires de base du
génome (3.3 x 109) humaines. Ainsi, un deuxième
oligonucléotide ou amorce a été ajouté pour bloquer la progression
de la synthèse de la première amorce. Plus tard
cependant, cette deuxième amorce a été incluse pour lier à l'autre
brin d'ADN, de sorte que chaque brin de l'allèle de mutant contribue
au signal certain. Si l'arrangement comportant
l'hybridation simultanée des amorces à chaque brin était modifié
en chauffant le mélange et puis en répétant le recuit et les
étapes d'extension, alors le signal primaire serait encore autre
accru. La répétition des étapes permettrait aux
produits du premier rond d'être reproduits dans le deuxième cycle,
pour rapporter deux copies. La répétition du cycle
encore aurait comme conséquence quatre copies, et cetera. Plusieurs
semaines passées avant cette grande idée ont été essayées (8). Deux amorces ont été synthétisées pour être
parfaitement complémentaires à chaque fin de la région de base de
la paire 110 d'un segment copié du gène humain de b-globin,
l'amplification a été exécuté, et les produits ont été
identifiés par l'électrophorèse de gel d'acrylamide. Le résultat de fin était le fragment de base prévu
d'ADN de la paire 110 et le début de PCR comme technique de base dans
la biologie moléculaire (5.6).
Dans le PCR initial de Mullis process(5,6,8), l'enzyme a été
utilisée in vitro (dans un
environnement commandé en dehors d'une organization). L'ADN bicaténaire a été séparée dans deux brins
simples en la chauffant à 96°C. À cette température,
cependant, la polymérase d'ADN
d'E.Coli a été détruite de sorte que l'enzyme ait dû
être complétée le niveau après l'étape de chauffage de chaque
cycle. Le processus initial du PCR de Mullis était
très inefficace puisqu'il a exigé beaucoup de période, vastes
quantités d'ADN-Polymérase, et attention continuelle dans tout le
processus de PCR.
L'examen du mécanisme d'amplification de PCR
indiquent sa simplicité mais également son élégance (le schéma
2). Des amorces d'oligonucléotide sont d'abord conçues
pour être complémentaires aux fins de l'ordre à amplifier, et alors
mélangé dans l'excès molaire au descripteur d'ADN et les
deoxyribonucleotides dans une mémoire tampon appropriée. Chauffage suivant pour dénaturer les brins d'original
et le refroidissement pour favoriser le recuit mieux habillé, les
oligonucléotides chaque grippage à un brin différent du fragment de
cible. Les amorces sont placées de sorte que quand
chacun est étendu par l'action d'une polymérase d'ADN, les brins
nouvellement synthétisés superposent l'accepteur de
l'oligonucléotide opposé. Pendant que le processus de
la dénaturation, du recuit, et de l'extension de polymérase est
continué les amorces lient à plusieurs reprises au descripteur
initial d'ADN et aux sites complémentaires dans les brins
nouvellement synthétisés et sont étendues pour produire de
nouvelles copies d'ADN (le schéma 3). Le résultat de
fin est une augmentation exponentielle de tout le nombre de fragments
d'ADN qui incluent les ordres entre les amorces de PCR, qui sont
finalement représentées à une abondance théorique de 2n, où n est
le nombre de cycles (1.7.13).
Une polymérase d'ADN est une enzyme naturelle, une macromolécule
biologique qui catalyse la formation et la réparation de l'ADN.
Cela fonctionne à côté de lier à un brin simple d'ADN et de
créer un brin complémentaire. La réplique précise de
toute la matière vivante dépend de cette activité, où elle
fonctionne pour reproduire l'ADN quand les cellules se divisent
(10.11). Ayez tout récemment les scientifiques appris
pour manipuler cette activité et pour s'appliquer l'à la recherche
scientifique. Les expériences de PCR les plus tôt
utlilized le fragment de Klenow de la polymérase I d'ADN
d'Escherichia coli à une température de 37C pour amplifier les
cibles spécifiques d'ADN genomic humaine (5.6). Souvent
ces réactions de PCR ont produit le produit incomplètement pur de
cible comme jugé par l'électrophorèse de gel (1). Ces
amplifications initiaux de PCR avec le fragment de Klenow n'étaient
pas fortement spécifiques (5.6). Bien qu'un seul
fragment d'ADN pourrait être le pli ~200,000 amplifié de l'ADN
genomic, seulement environ 1% du produit de PCR était l'ordre visé
(13). Une sonde spécifique d'hybridation a été
exigée pour analyser l'ADN amplifiée (5.6).
Des états d'un certain PCR ont été déterminés pour
augmenter la raideur de l'hybridation mieux habillée telle que des
concentrations inférieures en mgcl2 et des températures plus
élevées de recuit.
En outre, tous la concentration de l'enzyme et des amorces, la
période de recuit, le temps d'extension, et le nombre de PCR fait un
cycle se sont avérés effectuer la spécificité du PCR.
En outre, la concentration d'un ordre spécifique dans un
échantillon peut également influencer la homogénéité relative des
produits de PCR (1.7.13.14.15). Les triphosphates et le
magnésium de Deoxyribonucleotide dans une mémoire tampon appropriée
sont également les ingrédients importants pour PCR. L'efficacité et la spécificité de PCRs peuvent être
affectées par des variations de la concentration et du taux du
magnésium, des triphosphates de deoxyribonucleotide, et des amorces
libres. Ces réactifs doivent être optimalisés afin de
réaliser la spécificité et le rendement élevés (14). On l'a également découvert que l'effet de la
température et de la longueur d'amorce d'oligonucléotide sur la
spécificité et l'efficacité de l'amplification par la réaction en
chaîne de polymérase (15).
L'inactivation du fragment de Klenow de la polymérase I
d'ADN d'Escherichia coli à température élevée exigée pour la
séparation de brin a exigé l'ajout de l'enzyme après l'étape de
dénaturation de chaque cycle (5.6). Avant 1988,
n'importe qui conduisant un procédé de réaction de PCR a été
obligé pour se reposer patiemment par une série de bains de l'eau ou
de blocs de chauffage et pour ajouter une partie aliquote fraîche de polymérase d'ADN
d'E.Coli après chaque étape de dénaturation, qui a
été typiquement effectuée en immergeant le navire de réaction dans
l'eau bouillante pour ½ ; une minute à 3 minutes (7). On a éliminé cette étape plutôt pénible par
l'introduction d'une polymérase thermostable d'ADN, la polymérase d'ADN de Taq
(12) par le passé, au début de la réaction de PCR. Les propriétés thermostables de l'activité de
polymérase d'ADN ont été isolées dans l'aquaticus de Thermus (Taq)
(le schéma 4) qui se développent en geysers de 110C fini, et ont
contribué considérablement au rendement, à la spécificité, à
l'automatisation, et à l'utilitaire de la réaction en chaîne de
polymérase (1.7.12). L'enzyme de Taq peut résister au chauffage répété à 94C
et ainsi chaque fois que le mélange est refroidi pour permettre aux
amorces d'oligonucléotide de lier le catalyseur pour l'extension est
déjà présent (1.7). Cependant, les températures plus
élevées de recuit n'ont pas été établies jusqu'au développement “le plus important simple du développement de PCR” (8), de la purification et de la distribution
commerciale d'une polymérase anti-calorique d'ADN de
l'aquaticus thermophile de Thermus de
bactérie (Taq) (12).
L'isolement d'une polymérase anti-calorique d'ADN a également
permis le recuit mieux habillé et l'extension à effectuer aux
températures élevées (1.7.12.13), réduisant de ce fait a mal
adapté le recuit aux ordres de nontarget (amplification non
spécifique) ou à la spécificité croissante. De cette
façon, parce que beaucoup d'amplifications le produit de PCR pourrait
être détecté comme bande bromure-souillée par éthidium simple sur
un gel électrophorétique (12). Cette spécificité
accrue a également augmenté le rendement d'ADN de l'ordre de cible. D'ailleurs, de plus longs produits de PCR ont pu être
amplifiés de l'ADN genomic, probablement due à une réduction de la
structure secondaire des brins de descripteur à la température
élevée utilisée pour l'extension mieux habillée. La
limite supérieure de taille pour l'amplification de polymérase de
fragment de Klenow était seulement au sujet de 400bp. La polymérase de Taq et d'autres polymérases
thermostables ont synthétisé des fragments jusqu'à 10 KBS
(1.7.12.13). La disponibilité de la
polymérase de Taq également a
considérablement simplifié l'automatisation de la réaction car il
est beaucoup un plus facile chargent de construire un appareil
qui fera un cycle un tube de réaction par les différentes
températures que pour fabriquer un dispositif qui exécuterait
thermocycling et l'ajout des parties aliquotes d'enzymes. Il y a actuel une grande variété de thermocyclers
disponibles commercialement. Ce développement a été
un facteur significatif dans l'application rapide de cette technologie
par la communauté scientifique (7).
En plus de la production des fragments
bicaténaires et émoussé-terminés d'ADN qui peuvent être
constitués par PCR, deux autres dispositifs du PCR complotent
contribuent considérablement à l'utilitaire de PCR. D'abord, la position de l'attache des amorces définit
les bornes du fragment amplifié et donc la condition moléculaire
antérieure de clonage des sites d'identification de ribonucléase de
restriction n'est pas exigée pour PCR. Car seulement un
nombre limité d'ordres d'ADN sont des sites de restriction, PCR
augmente considérablement la flexibilité du choix de la taille et de
la composition de fragment. Deuxièmement, il n'est pas
que les oligonucléotides de PCR soient exactement complémentaire à
l'ADN de descripteur. “Des queues” peuvent
être ajoutées à l'extrémité’ 5 de l'amorce pour
présenter des ordres dans les sites d'amoricage qui peuvent être
exploités ainsi pour présenter des sites d'identification de
ribonucléase de restriction ou d'autres ordres utiles tels que des
mutations dans l'ADN amplifiée. Ce les phénomènes ont
permis l'apparition de PCR comme méthode pour le clonage rapide d'ADN
(1.7.13).
Le clonage moléculaire a tiré bénéfice de
l'apparition de PCR comme technique. Le clonage direct a
été conduit la première fois en utilisant un fragment d'ADN de 110
points d'ébullition amplifié par PCR et les amorces
d'oligonucléotide qui ont contenu des sites d'identification de
ribonucléase de restriction ont ajouté à leurs 5’ extrémités. Ces sites ont été
employés pour faciliter le clonage de l'ADN amplifiée dans un
plasmide M13 (17). Le fragment de 110 points
d'ébullition a été également ordonnancé pour confirmer que cette
approche était une approche rapide pourtant fiable au clonage. (le schéma 5)
Le clonage cellulaire d'ADN implique la réplique
d'ADN in vivo, qui est
associée à une fidélité très élevée de copier en raison de
corriger des mécanismes. Cependant, quand l'ADN est
repliée in vitro comme avec
PCR, la cadence d'erreur copiante est considérablement plus grande. La polymérase le plus largement répandue, polymérase d'ADN de Taq
cependant, n'a aucun exonuclease 3’à 5’ associé à conférer une fonction corrigeante. Ainsi la cadence d'erreur due au misincorporation de
base pendant la réplique d'ADN est plutôt haute pour Taq: pour un 1 KB ordonnancez
qui a subi 20 cycles pertinents de duplication, approximativement 40%
des nouveaux brins d'ADN synthétisé par PCR utilisant cette enzyme
contiendra un nucléotide incorrect en résultant d'une erreur
copiante (16). Par conséquent, même si la réaction de
PCR implique l'amplification d'un ordre simple d'ADN, le produit final
sera un mélange d'apparier presque, mais des ordres non identiques
d'ADN. En dépit des erreurs dues à la réplique in vitro, l'ordonnancement
d'ADN de tout le produit de PCR peut donner l'ordre correct étant
donné que l'incorporation des bases incorrectes est essentiellement
aléatoire et la contribution d'une base incorrecte sur un ou
plusieurs brins est accablée par les contributions de la majorité
énorme de brins qui auront l'ordre correct. Cependant,
si le produit de PCR doit être copié en cellules, plusieurs
l'individu copie peut devoir être ordonnancé afin de déterminer
l'ordre correct (de consensus), avant d'autres expériences de
conduite.
Plus récemment, le problème de l'infidélité de la réplique
d'ADN pendant la réaction de PCR a été considérablement réduit en
utilisant les polymérases thermostables alternatives d'ADN qui ont
associé l'activité’ de l'exonuclease 3’ à
5. Les polymérases et le
ThermococcusLitoralis(ÉVENT) d'ADN de furiosus de
Pyrococcus (Pfu) deviennent plus
extensivement ont utilisé en raison de corriger conféré par
l'activité de leur exonuclease’ 3 à’ 5
associé (18). Le produit résultant de PCR de Pfu par
exemple, a beaucoup de niveau plus bas des mutations présentées en
copiant des erreurs : pour un segment de 1 KB de l'ADN qui a
subi 20 cycles pertinents de duplication, environ 3.5% de l'ADN
échoue dans le produit portent une base modifiée (16).
De nouvelles approches pour améliorer la
spécificité ont été développées ont basé sur l'identification
que la polymérase d'ADN de Taq maintient l'activité enzymatique
considérable aux températures bien au-dessous de l'optimum pour la
synthèse d'ADN. Ainsi, les amorces recuisant
non-specifically à une région échouée partiellement simple de
descripteur peuvent être étendues avant que la réaction atteigne
72°C pour l'extension des amorces spécifiquement recuites. Si la polymérase d'ADN est lancée seulement après que
la réaction a atteint (> 70°C) les températures élevées,
l'amplification de non-cible peut être réduit au minimum (19.20). Cette “approche de début” chaud peut être accomplie par l'ajout manuel d'un
réactif essentiel au tube de sélection aux températures élevées. On a également enregistré que l'ajout de la protéine
obligatoire de ssDNA augmente l'amplification spécifique. Une approche plus conviviale est d'utiliser l'inhibition
ou l'inactivation de la polymérase d'ADN elle-même. Deux types d'inhibition de polymérase d'ADN de Taq ont
été essayés comprenant l'inhibition d'oligonucléotide (21) et
l'inhibition de l'anticorps (22). Des inhibiteurs fortement
spécifiques d'oligonucléotide des deux polymérases d'ADN de Taq ont
été produits. Ceux-ci empêchent sélectivement
l'activité de polymérase d'ADN aux températures au-dessous de 40°C
et ont été montrés à la fonction dans des applications de début
chaud. Alternativement, on peut utiliser un anticorps
contre la polymérase d'ADN de Taq. L'anticorps empêche la
polymérase d'ADN jusqu'à ce que la température du PCR soit telle
que l'anticorps est dénaturé à une température 55°C plus grand
que, libérant de ce fait l'enzyme. De quelque manière
qu'il y a des inconvénients à ce type d'états de début chaud. Dans ce cas-ci, on a besoin d'un anticorps pour chaque
enzyme différente utilisée dans un PCR et pour un grand nombre de
PCRs ceci peut se lever des coûts de manière significative. La forme la plus commode du début chaud doit modifier
la polymérase d'ADN de telle manière qu'elle soit inactive à la
température ambiante (mutant température-sensible), et est seulement
réactivée après incubation à 95°C pendant 6-15 minutes (23).
En raison de sa simplicité, PCR est une
technique populaire avec une étendue des applications large
y compris l'ordonnancement direct, le clonage genomic,
l'ADN tapant, la détection des micro-organismes infectieux, la
mutagénèse site-dirigée, la recherche génétique prénatale de la
maladie, et l'analyse des variations allelic d'ordre (1.7.13.16) qui
dépendent d'essentiellement trois avantages principaux de la méthode
:
Vitesse et facilité d'utilisation : Le clonage d'ADN par PCR peut être exécuté dans une
quantité de temps relativement courte, dans quelques heures. Habituellement, une réaction de PCR se compose d'autour
30 cycles chaque cycle contenant une dénaturation, synthèse et
reannealing l'étape, avec un cycle individuel prenant typiquement 3
5 minutes dans un cycler thermique automatisé. C'est clairement plus rapide que le temps requis pour le
clonage cellulaire d'ADN, qui pourrait prendre des semaines de temps. En outre, il est tout à fait facile d'installer une
réaction de PCR et l'utilisation d'une machine de thermocycler est
également facile. Une certaine heure est exigée pour
la conception et la synthèse des amorces d'oligonucléotide, mais
ceci a été simplifié par la disponibilité du logiciel d'ordinateur
pour la conception mieux habillée et la synthèse rapide de film
publicitaire ou d'universitaire des oligonucléotides faits sur
commande. L'optimisation des états de PCR peut être
exigée comme la température mieux habillée de recuit, la
concentration en magnésium, et la concentration mieux habillée. Cependant, la création des machines du gradient PCR qui
permettent à une variété des températures mieux habillées de
recuit d'être testée en même temps a considérablement diminué le
temps requis pour cette étape. Une fois les conditions
optimales pour une réaction ont été obtenues, la réaction peuvent
alors être simplement répétées (1.7.13.16).
Sensibilité : PCR est capable
d'amplifier les ordres des quantités minutieuses d'ADN de cible,
même l'ADN d'une cellule (24). Une telle sensibilité
exquise a eu les moyens de nouvelles méthodes d'étudier la
pathogénie moléculaire et a trouvé de nombreuses applications en
science légale, dans le diagnostic, dans l'analyse génétique de
liaison en utilisant le simple-sperme tapant et dans des études
moléculaires de paléontologie, où les échantillons peuvent
contenir des nombres minutieux des cellules. Cependant, la
sensibilité extrême de la méthode signifie que le grand soin doit
être pris pour éviter la contamination de l'échantillon à l'étude
par l'ADN externe, comme des quantités minutieuses de cellules de
l'opérateur (1.7.13.16).
Robustesse : Un large intervalle
des sources d'acide nucléique conviennent les descripteurs pour
l'amplification de PCR. DNAs épuré de diverses
espèces et sources ont été amplifiés. PCR peut
permettre l'amplification des ordres spécifiques du matériel en
lequel l'ADN est mal dégradée ou encastrée dans un support duquel
l'isolement conventionnel d'ADN est problématique. En
conséquence, il est encore très approprié à l'anthropologie
moléculaire et la paléontologie étudie, par exemple l'analyse de
l'ADN récupérée des restes archéologiques. Elle également a
été employée avec succès pour amplifier l'ADN de formaline-fixe ou
les échantillons paraffine-encastrés de tissu, qui a des
applications importantes dans la pathologie moléculaire et, dans
certains cas, la liaison génétique étudie. Généralement, le succès de l'amplification de PCR est
le plus grand quand les fragments de cible sont relativement abondants
(1.7.13.16).
En dépit de son popularité énorme, PCR a
certaines limitations comme méthode pour copier sélectivement des
ordres spécifiques d'ADN.
Afin de construire les amorces spécifiques d'oligonucléotide
qui permettent l'amplification sélectif d'un ordre particulier d'ADN,
de l'information préalable d'ordre est habituellement nécessaire. Ceci signifie normalement que la région d'ADN
d'intérêt a été en partie caractérisée précédemment, clonage
cellulaire antérieur souvent suivant d'ADN. Cependant,
on a développé une variété d'approches qui réduisent ou même
excluent le besoin d'information préalable d'ordre d'ADN au sujet de
l'ADN de cible. Des ordres précédemment non
caractérisés d'ADN peuvent parfois être copiés en utilisant PCR
avec des oligonucléotides dégénérés s'ils sont les membres d'un
gène ou la famille réitérée au moins une d'ADN laquelle des
membres a été précédemment caractérisé. Dans
certains cas, PCR peut être employé pertinemment sans n'importe
quelle information préalable d'ordre au sujet de l'ADN de cible pour
permettre l'indiscriminateamplification des ordres d'ADN d'une source
de l'ADN qui est présente en quantité extemely limitée. Par conséquent, bien que PCR puisse être appliqué
pour assurer l'amplification entier de génome, il n'a pas l'avantage
du clonage cellulaire d'ADN en offrant une voie de séparer l'ADN
individuelle copie comporter une bibliothèque genomic d'ADN.
La quantité de produit de PCR obtenue en réaction simple est
également beaucoup plus limitée que la quantité qui peut être
obtenue en utilisant le clonage cellulaire où mesurez-vers le haut
des volumes de cultures de cellules est possible. L'efficacité
d'une réaction de PCR changera du descripteur au descripteur et selon
les divers facteurs qui sont exigés pour optimaliser la réaction
mais en général seulement un peu comparativement de produit sont
réalisés.
Bien que le rendement théorique de PCR soit exponentiel, le
rendement réel d'un PCR indique beaucoup moins que l'arrangement
fonctionne à de son potentiel maximum. Par exemple, la
quantité de produit à chaque cycle se stabilise par la suite. Ce plateau peut être expliqué par les phénomènes
suivants. D'abord, une partie du descripteur peut jamais
être due disponible aux ruptures de brin ou à la panne de l'ADN à
dissocié d'autres macromolécules pendant la purification et les
thermocycles initiaux. Deuxièmement, la quantité
d'enzyme est finie et par la suite l'activité peut diminuer. Troisièmement, car la concentration du produit
bicaténaire atteint les niveaux élevés, la concurrence augmente
entre le recuit du descripteur (produit de PCR) à l'amorce et de
reannealing des brins complémentaires de descripteur (1.7.13).
Un inconvénient évident et de beaucoup de fois grand de PCR
comme méthode de clonage d'ADN a été la classe de grandeur des
ordres d'ADN qui peuvent être copiés. À la
différence du clonage cellulaire d'ADN où la taille des ordres
copiés d'ADN peut approcher le mb 2, enregistré des ordres d'ADN
copiés par PCR ont typiquement été en 0.1
5 KBS de
classe de grandeur, souvent à l'extrémité inférieure de cette
échelle. De petits fragments de l'ADN peuvent
habituellement être amplifiés facilement par PCR, toutefois il
devient de plus en plus plus difficile d'obtenir l'amplification
efficace à mesure que la longueur désirée de produit augmente. Barnes (25) a identifié une limitation de longueur de
cible à l'amplification de PCR de l'ADN. Il a utilisé
une combinaison d'un niveau élevé d'un exonuclease-libre, mutant de
suppression de N-terminal de la polymérase d'ADN de Taq, Klentaq1,
avec un niveau très bas d'une polymérase thermostable d'ADN montrant
une activité 3'-exonuclease (Pfu, évent, ou évent profond) pour
conduire la fidélité élevée longtemps PCR. Au moins 35 KBS
du bactériophage lambda peuvent être amplifiés aux rendements
élevés de 1 NG de descripteur d'ADN de lambda. L'utilisation de cette méthode a rapporté la
fidélité accrue de base-paire, la capacité d'utiliser des produits
de PCR comme amorces, et le rendement maximum du fragment de cible. D'autres conditions ont été identifiées pour
l'amplification pertinent de plus longues cibles, y compris
l'amplification de jusqu'à 22 KBS de la bêta-globin batterie de
gène de l'ADN genomic humaine et de jusqu'à 42 KBS d'ADN du phaga
lambda (26). Les conditions pour ces longs PCRs ont
inclus pH accru, ajout de glycérol et de sulfoxyde diméthylique,
diminué des temps de dénaturation, accru des temps d'extension, et
l'utilisation d'une polymérase thermostable secondaire d'ADN qui
possède un 3'-to 5'-exonuclease, ou de "corriger," activité. Le protocole de "long PCR" a mis à jour la
spécificité exigée pour des cibles en ADN genomic en utilisant des
niveaux plus bas de polymérase et des états de la température et de
sel pour le recuit spécifique d'amorce. La capacité
d'amplifier des ordres d'ADN de 10-40 KBS apportera la vitesse et la
simplicité de PCR à tracer genomic et à ordonnancer et facilitera
des études dans la génétique moléculaire (26). Généralement, les conditions pour le long intervalle
PCR comportent une combinaison des modifications aux conditions
standard d'un système de deux-polymérase. Ceci fournit
les niveaux optimaux de l'activité de polymérase et d'exonuclease’3 à’ 5 d'ADN qui sert de mécanisme
corrigeant (16).
Thermocyclers qui règlent automatiquement les
températures pour le cycle de PCR ont été présentés en 1986 (le
schéma 6). En plus des avances en réactifs de PCR, de
nouveaux instruments pour l'courant ascendant automatisé faisant un
cycle et pour analyser des produits de PCR ont été développés. Les nouveaux cyclers thermiques ont augmenté des
cadences du chauffage, du refroidissement, et du transfert thermique
aux navires modifiés de réaction. Les navires de
réaction facilités par les cyclers thermiques de génération (ou
même des bains de l'eau et des blocs de chauffage) étaient les tubes
en plastique standard de microfuge. L'amplification de
PCR dans des tubes capillaires minces a permis le cycle thermique
rapide, et la synthèse d'ADN à 20s. La vitesse des
changements de température réalisés dans ces systèmes a permis la
définition précise des optimums de la température pour chaque
étape individuelle dans le cycle de PCR. Les cyclers
thermiques de nouvelle génération également facilitent plus
d'échantillons, ont des profils thermiques plus précis, et sont
programmables (13).
Une des moindres contributions appréciées à
l'application répandue de PCR a été le développement de la chimie
automatisée fiable pour la synthèse d'oligonucléotide. Jusque récemment, la construction d'un oligonucléotide
simple était une partie essentielle chargent qui pourrait
seulement être exécutée par un chimiste organique habile. Maintenant il est possible d'acheter l'un ou l'autre un
synthétiseur d'oligonucléotide qui peut être actionné par un
technicien ou les oligonucléotides eux-mêmes à partir d'une source
de film publicitaire ou d'universitaire. Des machines
multiplex de synthèse d'oligonucléotide ont été construites dans
le but de réduire le coût global de la synthèse (27.28). Car les oligonucléotides définissent les produits
certains de PCR, il n'est guère douteux qu'en l'absence de leur
approvisionnement prêt, PCR n'aurait pas apprécié l'acceptation
large qu'il a gagnée aujourd'hui (13).
Les chercheurs ont convenu dès l'abord que la
conception des amorces de PCR était difficile et incertaine. Des programmes machine ont été conçus pour tenir
compte de tous les critères de conception. Un des
premiers programmes écrits pour la conception mieux habillée était
Olga qui s'est servi de la mise en place de la GEMME de recherches de
Digital (gestionnaire d'environnement de graphiques) sur la rue
d'Atari (29). Olga a été spécifiquement convenu à la
réaction en chaîne de polymérase (PCR) permettant l'analyse
simultanée de deux ordres mieux habillés. L'avantage
d'Olga était qu'il a fourni dans des analyses d'un programme pour des
répétitions directes, des structures secondaires et la dimérisation
mieux habillée comme plusieurs outils utiles de 'finissage 'pour des
ouvriers occupés dans des synthèses d'optimisation et
d'oligonucléotide de PCR. Le programme Primer3 à
l'institut de Whitehead est maintenant pensé pour être l'outil le
plus fiable et le plus souple actuellement disponible (30).
PCRs peut maintenant être exécuté permettant
l'amplification des fragments d'ADN jusqu'à plusieurs kilobases dans
la longueur par plus d'un million de fois leur abondance initiale. Le procédé est fortement automatable et a besoin de
juste quelques heures de commencer thermocyling à l'analyse de
produit. Ce n'était pas le cas précédemment, et les
conditions pratiques pour exécuter un PCR ont été considérablement
simplifiées depuis les premiers manuscrits de la méthode (13). Aujourd'hui, la plupart des accrocs initiaux ou des
inefficacités du PCR ont été établies (8). En outre,
PCR a augmenté pour inclure plus de 270.000 articles (31).
La réaction en chaîne de polymérase est la méthode le plus largement répandue pour l'amplification in vitro d'ADN cependant qu'il exige la dénaturation thermique ou thermocycling pour séparer les deux brins d'ADN. In vivo, l'ADN est repliée par des polymérases d'DNA avec de diverses protéines annexes. Le helicase d'ADN, les protéines annexes d'une polymérase d'ADN agit de séparer l'ADN duplex à l'intérieur des cellules. Vincent et autres. (32) ont conçu une nouvelle méthode isotherme in vitro d'amplification d'ADN en imitant le mécanisme in vivo de réplique. l'amplification Helicase-dépendant (HDA) utilise un helicase d'ADN pour produire des descripteurs simple-échoués pour l'hybridation mieux habillée. L'extension ultérieure d'amorce est alors catalysée par une polymérase d'ADN. HDA n'exige pas un thermocycler cher et PCR peut être exécuté ainsi pratiquement n'importe où. En outre, il offre plusieurs avantages par rapport à d'autres méthodes isothermes d'amplification d'ADN en ayant un arrangement simple de réaction et en étant une véritable réaction isotherme qui peut être exécutée à l'une température pour le processus entier. HDA offre la grande promesse dans le développement des dispositifs diagnostiques portatifs simples d'ADN d'être utilisé dans le domaine et au point-de-soin (32).
On lui dit que la voie la plus simple et la plus
commode de définir PCR est comme technique. Cependant,
une telle catégorisation élimine l'histoire du développement de
PCR's autant d'individus au cours des années contribuées aux idées
derrière la théorie de PCR et le fin-accord de la technique. La prochaine réponse la plus simple doit nommer un
individu en tant qu'inventeur de la réaction en chaîne de
polymérase. Karry Mullis a été attribué le prix
Nobel pour la chimie en 1993 pour sa découverte de PCR. Cependant, cette découverte est contestée parmi
beaucoup de scientifiques, qui ont pu avoir contribué à
déverrouiller ce puzzle.
On lui a également dit que PCR n'a pas existé jusqu'à ce
qu'il ait été fait fonctionner dans un système expérimental. À cet effet, simplement la pensée d'un concept n'est
pas suffisante ; un concept doit avoir été avec succès mis en
pratique (33).
Bien qu'il y ait doute quant au créateur final de PCR, et doute
quant à la possibilité que PCR peut de façon ou d'autre ou
autrefois être substitué, il y a peu doute l'impact que PCR a créé
au-dessus d'une période courte sur l'étude de la biologie et de la
vie moléculaires.
Références
1. Arnheim, N ; Erlich, H ; Stratégie de Réaction en chaîne de Polymérase. REVUE ANNUELLE ANNUELLE DE LA BIOCHIMIE, VOL. 61.
XIV+1359P. , 1992. p. 131-156.
2. Appenzeller T. Democratizing l'ordre d'ADN, le Science, 1990 mars 2,
247(4946).
3. Saiki R, K. ; Scharf S ; Faloona F
; Mullis K. B ; Klaxon G. T ; Erlich H. A. ;
Arnheim N., amplification enzymatique de bêtas-globin ordres
genomic et analyse de site de restriction pour le diagnostic de
l'anémie de cellules de faucille, le
Science, DEC 1985 20, 230(4732):1350-4.
4. Méridional, E.M. (1975) La
détection des ordres spécifiques parmi des fragments d'ADN a
séparé par l'électrophorèse de gel. J. Mol. Biol.
98:503-518.
5. Mullis K. B ; Faloona F. A ;
Scharf S ; Saiki R. K ; Klaxon G ; Erlich H.
A., amplification enzymatique spécifique de l'ADN in vitro :
la réaction en chaîne de polymérase. Colloquesfroidsde port de ressort sur Biology
quantitatif, 1986
6. Mullis K. B ; Faloona F.
A. Synthèse spécifique de l'ADN in vitro par
l'intermédiaire d'une réaction en chaîne polymérase-catalysée. Méthodes en Enzymology, 1987,
155:335-50.
7. Gibbs, R.A ; Amplification d'ADN par la
réaction en chaîne de polymérase. Chemie Analytique,
1990, 62:1202-1214.
8. Mullis, K.B ; L'origine peu commune de la
réaction en chaîne de polymérase, Américain scientifique, avril
1990.
9. Kleppe, KE ; Khorana,Hectogramme ; (1971) J. Mol.
Biol. 56, 341-346.
10. Keir, H ; Polymérases d'ADN des
cellules mammifères. Mole de Biol de Recherche
d'Acide Nucléique de Prog. 1965;4:81-128.
11. Fansler, BS ; Polymérases d'ADN
d'Eukaryotic : leur association avec le noyau et rapport avec la
réplique d'ADN. Tour Interne Cytol. 1974;Suppl 4:363-415.
12. Saiki R. K ; Gelfand D. H ;
Stoffel S ; Scharf S. J ; Higuchi R ; Klaxon
G. T ; Mullis K. B ; Erlich Ha. amplification
enzymatique Amorce-dirigé de l'ADN avec de la polymérase
thermostable d'ADN. Le Science, 1988 Janv. 29, 239(4839):487-91.
13. Erlich, H. A ; Gelfand, D ;
Sninsky, J. J. Recent Advances dans la réaction en chaîne de
polymérase, le Science, 1991,
v.252, n.5013, 1643-1651.
14. Williams, JF ; Stratégies
d'optimisation pour la réaction en chaîne de polymérase. Biotechniques. 1989
Jul-Aug;7(7):762-9.
15. Wu DY, Ugozzoli L, Pal BK, Qian J, RB de
Wallace. L'effet de la température et de la longueur
d'amorce d'oligonucléotide sur la spécificité et l'efficacité de
l'amplification par la réaction en chaîne de polymérase. Biol de Cellules d'ADN. 1991
Apr;10(3):233-8.
16. Strachan, T ; Lisez A.P ; La Génétique Moléculaire Humaine 2.
1999. Section 1 Du Chapitre 6 De John Wiley & Sons Inc..
17. Scharf S. J ; Klaxon G. T ; Erlich
H. A. Analyse directe de clonage et d'ordre des ordres
genomic enzymatiquement amplifiés. Le
Science, 1986 Sept 5, 233(4768):1076-8.
18. Cline J, Braman JC, Hogrefe HH ;
Fidélité de PCR de polymérase d'ADN de pfu et d'autres
polymérases thermostables d'ADN. Recherche
d'Acides Nucléiques. 1996 sept 15;24(18):3546-51.
19. Falooea, F., Weiss, S., Ferre, F., Mullis, K.
1990 6èmes Int.Conf. SIDA. Résumé.
20. D’Aquila, R.T., Bechtel, L.J.,
Videler, J.A, Eron, J.J., Goeczyca, P., Kaplan, J.C. 1991. Recherche d'Acides Nucléiques. 19:3749.
21. Dang C, Écart-type de Jayasena. Les
inhibiteurs d'oligonucléotide de la polymérase d'ADN de Taq
facilitent la détection de basses cibles de nombre de copie par PCR.
Mole de Biol de J. 1996 nov. 29;264(2):268-78.
22. Kellogg De, Rybalkin I, Chen S, Mukhamedova
N, Vlasik T, Palladium de Siebert, Chenchik A. TaqStart Antibody :
"le début chaud" PCR facilité par un anticorps monoclonal
neutralisant a dirigé contre la polymérase d'ADN de Taq.
Biotechniques. 1994 Jun;16(6):1134-7.
23. Mb de Kermekchiev, Tzekov A, Barnes WM.
les mutants Froid-sensibles de la polymérase d'ADN de Taq
fournissent un début chaud pour PCR. Recherche d'Acides
Nucléiques. 2003 nov. 1;31(21):6139-47.
24 H. Li, U.B. Gyllenstein, X. Cui, R.K.
Saiki, H. Ehrlich, et N. Arnheim. (1988). Amplification et
analyse des ordres d'ADN en sperme humain simple et nature
diploïde 335 de cellules
: 414-417.
25. Barnes WM. ; Amplification de PCR de
jusqu'à ADN 35-kb avec la fidélité élevée et le rendement élevé
des descripteurs de bactériophage de lambda. Proc Acad National
Sci Etats-Unis. 1994 mars 15;91(6):2216-20.
26. Amplification de Cheng S, de Fockler C, de
Barnes WM, de Higuchi R. Effective de longues cibles des insertions
copiées et ADN genomic humaine. Proc Acad National Sci
Etats-Unis. 1994 juin 7;91(12):5695-9.
27. Caruthers MH, ANNONCE de Barone, Beaucage SL,
Dodds DR, Fisher EF, McBride LJ, Matteucci M, Stabinsky Z, Saveur JY. Synthèse chimique des deoxyoligonucleotides par la
méthode de phosphoramidite. Méthodes Enzymol.
1987;154:287-313.
28. Beattie kilolitre, Logsdon NJ, Anderson RS,
Espinosa-Lara JM, Maldonado-Rodriguez R, technologie de synthèse de
gène du gel JD 3ème : développements récents et futures
perspectives. Biochimie de Biotechnol APPL. 1988
Dec;10(6):510-21.
29. Passerelles CG.. Olga -- programme de
conception d'amorce d'oligonucléotide pour la rue d'Atari. Comput APPL Biosci. Apr;6(2):124-5 1990.
30. Rozen S, Skaletsky H. Primer3 sur le WWW pour
les utilisateurs généraux et pour des programmeurs de biologiste.
Mole de Biol de Méthodes. 2000;132:365-86.
31. World Wide Web d'emplacement : recherche
de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed : “PCR”
32. Vincent M, Xu Y, amplification
isotherme Helicase-dépendant d'ADN de Kong H.. Représentant
d'EMBO. 2004 Aug;5(8):795-800. Epub 2004 Juillet 09.
33. Paul Rabinow. Fabrication
de PCR, une histoire de la biotechnologie,
université de la presse de Chicago, 1996
Déni/limites de service &
Politique d'Intimité& ©2005-2007 Station.com moléculaire, tous droits
réservés.
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
Envoyez cette page à un ami