Expression de recombinaison de protéine

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Quand vous voulez caractériser un gène ou une protéine d'intérêt, vous devez d'abord étudier sa fonction. Dans cette ère moléculaire, l'obtention d'un cDNA de votre gène d'intérêt n'est pas difficile.

Pour exprimer le cDNA comme protéine, IE. une protéine de recombinaison, une peut alors facilement réaliser des études fonctionnelles utilisant la protéine épurée de recombinaison.

Une fois que vous avez une protéine épurée vous pouvez conduire :

• expériences d'interaction de Protéine-protéine
• Cinétique d'enzymes
• Études fonctionnelles de la protéine
• Études structurales - comprenant la cristallisation de protéine, la structure de protéine et RMN.
• Vous pouvez également employer la protéine pour préparer des anticorps pour d'autres expériences.

Il y a deux systèmes principaux pour l'expression de la protéine de recombinaison. Une fois que vous obtenez votre cDNA copié, vous devez décider où vous voulez amplifier votre protéine. Ce sera (habituellement un système procaryotique (bactérien) ou eucaryotique de levure ou de cellules mammifères). Le choix de votre système décidera dans quel vecteur vous devrez copier votre cDNA car il y a de différents instigateurs qui fonctionnent dans Escherichia coli et d'autres qui fonctionnent bien avec de la levure ou les systèmes mammifères.

Ainsi que le système d'expression de protéine vous utilisent ?

 Systèmes pour l'expression de protéine

Systèmes procaryotiques d'expression de protéine

Les systèmes de recombinaison procaryotiques d'expression de protéine ont plusieurs avantages. Ceux-ci incluent la facilité de la culture, et la signification très rapide de croissance de cellules que vous ne devrez pas attendre longtemps pour obtenir la protéine des systèmes bactériens une fois que vous copiez votre cDNA. L'expression peut être induite facilement dans les systèmes bactériens d'expression de protéine utilisant IPTG. En outre, la purification est tout à fait simple dans les systèmes procaryotiques d'expression et il y a une pléthore de kits commerciaux disponibles pour l'expression de recombinaison de protéine.

D'une part, si vous devez utiliser vos protéines pour des études fonctionnelles ou enzymatiques les systèmes procaryotiques sont un problème pendant que la plupart des protéines deviennent insolubles dans des corps d'inclusion et sont très difficiles à récupérer en tant que protéines fonctionnelles. En outre, les la plupart sinon toutes les modifications poteau-de translation ne sont pas ajoutées par des bactéries et donc votre protéine d'intérêt peut ne pas être fonctionnelle. Les études enzymatiques peuvent être ainsi stériles.

Systèmes eucaryotiques d'expression

Les gènes eucaryotiques ne sont pas vraiment « à la maison » en cellules procaryotiques, même lorsqu'ils sont exprimés sous la commande des vecteurs procaryotiques.  Une raison est que les cellules d'Escherichia coli fréquemment identifient les produits de protéine des gènes eucaryotiques copiés comme étrangers et les détruisent.  Un autre est que les prokaryotes n'effectuent pas les mêmes genres de modification de posttranslational que les eukaryotes font.  Par exemple, une protéine qui serait d'habitude couplée aux sucres dans une cellule eucaryotique sera exprimée comme protéine nue quand copié en bactéries.  Ceci peut effectuer l'activité ou la stabilité d'une protéine, ou au moins sa réponse aux anticorps.  Plus de problème grave est que l'intérieur d'une cellule bactérienne n'est pas comme favorisant le pliage approprié des protéines eucaryotiques comme intérieur d'une cellule eucaryotique.  Fréquemment, le résultat est incorrectement plié, les produits inactifs des gènes copiés. 

Les systèmes eucaryotiques pour l'expression de la protéine incluent :

• levure
• cellules mammifères
• cellules de baculovirus (insecte)

Tous ces systèmes sont de grands systèmes eucaryotiques pour l'expression des protéines de recombinaison.
Les avantages des systèmes eucaryotiques d'expression de protéine incluent le fait que vous pouvez obtenir très des niveaux élevés d'expression. Il est facile épurer les protéines utilisant les étiquettes spéciales qui sont incluses dans les vecteurs comprenant le sien, le Myc et d'autres étiquettes.

Vous pouvez même acheter les plasmides qui sécrètent votre protéine dans les medias. Par conséquent vous pouvez continuer à élever votre système et à rassembler les medias sans lyser vos cellules. Il n'y a aucun corps d'inclusion à s'inquiéter pour et vos protéines ont des modifications poteau-de translation intactes. Ce sont essentiels si vous étudiez la fonction des interactions d'une protéine et/ou de protéine-protéine.

Les inconvénients des systèmes eucaryotiques d'expression de protéine incluent le fait que les cellules eucaryotiques se développent plus lentes que les cellules procaryotiques.

Vecteurs d'expression avec les instigateurs forts

La fonction principale d'un vecteur d'expression est de rapporter le produit d'un gène habituellement, plus le produit le meilleur.  Par conséquent, des vecteurs d'expression sont d'habitude équipés des instigateurs très forts ; le raisonnement est que plus est produite ADN messagère, plus le produit de protéine sera fait.
Un tel instigateur fort est l'instigateur de trp (operon de tryptophane).  Il forme la base pour plusieurs vecteurs d'expression, y compris ptrpL1.  Il fait suivi une région d'instigateur/opérateur de trp, d'un accepteur de ribosome, et peut être employé directement comme vecteur d'expression en insérant un gène étranger dans le site de ClaI. Alternativement, la région de commande de trp peut être faite à « portable » en le découpant avec ClaI et HindIII et en l'insérant devant un gène à exprimer en un autre vecteur

Vecteurs induisibles d'expression

Il est habituellement avantageux de maintenir un gène copié represed jusqu'à ce que nous soyons prêts à l'exprimer.  Une raison est que les protéines eucaryotiques produites en grande quantité dans les bactéries peuvent être toxiques.  Même si ces protéines ne sont pas réellement toxiques, elles peuvent augmenter jusqu'à de grands niveaux d'Auch qu'elles gênent la croissance bactérienne.  Dans l'un ou l'autre cas, si on permettait au le gène copié de rester allumé constamment, les bactéries soutenant le gène ne deviendraient jamais une assez grande concentration pour produire des quantités signicatives de produit de protéine.  La solution est de maintenir le gène copié arrêté en le plaçant en aval de un instigateur induisible qui peut être arrêté.
L'instigateur de laque est induisible dans une certaine mesure, vraisemblablement restant hors fonction jusqu'à stimuler par l'isopropylthiogalactoside synthétique d'inducteur (IPTG).  Cependant, la répression provoquée par le répresseur de laque est inachevée, et une certaine expression du gène copié sera observée même en l'absence de l'inducteur.  L'one-way autour de ce problème est d'exprimer notre gène en plasmide ou phagemid qui porte son propre gène de lacI, comme le fait le pBS.  Le répresseur excessif produit par un tel vecteur maintient notre gène copié arrêté jusqu'à ce que nous soyons prêts à l'induire avec IPTG.
Une autre stratégie est d'utiliser un instigateur bien controlé en tant qu'instigateur bactériophage PL de λ. Des vecteurs d'expression avec ce système d'instigateur/opérateur sont copiés dans des cellules hôtes soutenant un gène thermo-sensible de répresseur de λ (c1857).  Tant que nous maintenons la température de ces cellules relativement basse (32°C), le répresseur fonctionne, et aucune expression n'a lieu.  Cependant, quand nous soulevons la température au niveau nonpermissive (42ºC), le répresseur thermo-sensible peut plus ne fonctionner et le gène copié est induit.

Vecteurs d'expression qui produisent des protéines de fusion

Quand la plupart des vecteurs d'expression fonctionnent, ils produisent des protéines de fusion.  Ceci pourrait d'abord sembler un inconvénient parce que le produit naturel du gène inséré n'est pas fait.  Cependant, les acides aminés supplémentaires sur la protéine de fusion peuvent être d'un grand secours en épurant le produit de protéine.

Considérez les vecteurs d'expression d'oligo-histidine, un dont a les pTrcHis de nom commercial.  Ceux-ci ont un ordre court juste d'amont du site multiple de clonage qui encode un bout droit de six histidines.  Ainsi, une protéine exprimée en un tel vecteur sera une protéine de fusion avec six histidines à son extrémité aminée.  Pourquoi voudrions-nous attacher six histidines à notre protéine ?  les régions d'Oligo-histidine comme ceci ont une affinité élevée pour des métaux comme le nickel, ainsi nous pouvons épurer les protéines qui ont de telles régions utilisant la chromatographie d'affinité de nickel.  La beauté de cette méthode est sa simplicité et vitesse.  Après que les bactéries aient fait la protéine de fusion, nous les lysons simplement, ajoutons l'extrait bactérien de srude à une colonne d'affinité de nickel, effaçons toutes les protéines non liées, puis libérons la protéine de fusion avec de l'histidine ou un imidazol appelé analogique d'histidine.  Ce procédé nous permet de moissonner essentiellement la fusion pure dans seulement une étape.  C'est possible parce que très peu si des protéines normales ont des régions d'oligo-histidine, ainsi notre protéine de fusion est essentiellement le seul qui lie à la colonne.

Ce qui si nous voulons notre sans protéines de l'étiquette d'oligo-histidine ? 

Les créateurs de ces vecteurs ont pensivement fourni une voie de la retirer.  Juste avant le site multiple de clonage, il y a une région de codage pour un bout droit des acides aminés identifiés par l'enterokinase d'enzymes protéolytiques.  Ainsi nous pouvons employer l'enterokinase pour fendre la protéine de fusion dans deux parts :  l'étiquette d'oligo-histidine et la protéine que nous voulons. Le site identifié par enterokinase est très rare, et la chance qu'elle existe en notre protéine est non significative.  Ainsi, notre protéine ne devrait pas être coupée vers le haut de pendant que nous retirons son étiquette d'oligo-histidine.  Si nous voulons, nous pouvons exécuter la protéine enterokinase-fendue par la colonne de nickel une fois de plus pour séparer les fragments oligo-hisitidine de la protéine d'intérêt.

les bactériophages de λ ont également servi de base aux vecteurs d'expression ;  on conçu est spécifiquement à cette fin λgt11.  Ce bactériophage contient une région de commande de laque suivie du gène de lacZ.  Les sites de clonage sont situés dans le gène de lacZ, ainsi les produits d'un gène inséré dans ce vecteur seront des protéines de fusion avec une amorce de B-galactosidase.
Le vecteur λgt11 d'expression est devenu un véhicule populaire pour faire et protéger des bibliothèques de cDNA.  λgt11 nous permet d'examiner un groupe de clones directement pour l'expression de la protéine droite.  Les ingrédients principaux exigés pour ce procédé sont bibliothèque de cDNA dans λgt11 et un antisérum dirigé contre la protéine d'intérêt.
Nous plaquons nos bactériophages de λ avec de diverses insertions de cDNA et épongeons les protéines libérées par chaque clone sur un support tel que la nitrocellulose.  Une fois que nous avons transféré les protéines à partir de chaque plaque à la nitrocellulose, nous sondons avec notre antisérum.  Ensuite, nous recherchons l'anticorps lié à la protéine d'une plaque particulière, utilisant la protéine étiquetée A de Staphylococcus aureus.  Cette protéine lie étroitement à l'anticorps et étiquette la tache correspondante sur la nitrocellulose.  Nous détectons cette étiquette par l'autoradiographie ou par phosphorimaging, puis allons à notre plat principal et sélectionnons la plaque correspondante.  Notez que nous détectent une protéine de fusion, pas la protéine d'intérêt elle-même.  En outre, il n'importe pas si nous avons copié un cDNA entier ou pas.  Notre antisérum est un mélange des anticorps qui réagiront avec plusieurs différentes parties de notre protéine, tellement même un gène partiel suffira, tant que sa région de codage est copiée dans la même trame d'orientation et de lecture que la région de codage de B-galactosidase.

Pour une revue de recombinaison rapide d'expression de protéine voyez :

Systèmes de recombinaison de protéine

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