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Expression de recombinaison de Protéine

Référence © Moléculaire 2006 De Copyright

Quand vous voulez caractériser un gène ou une protéine d'intérêt, vous devez d'abord étudier sa fonction. Dans cette ère moléculaire, l'obtention d'une ADN de votre gène d'intérêt n'est pas difficile.

Pour exprimer l'ADN comme protéine, l'IE une protéine de recombinaison, une peut alors facilement réaliser des études fonctionnelles en utilisant la protéine épurée de recombinaison.

Une fois que vous avez une protéine épurée vous pouvez conduire :

• Expériences d'Interaction de Protéine-protéine
• Cinétique d'Enzymes
• Études fonctionnelles de la protéine
• Études structurales - comprenant la cristallisation de protéine, la structure de protéine et RMN.
• Vous pouvez également employer la protéine pour préparer des anticorps pour d'autres expériences.

Il y a deux systèmes principaux pour l'expression de la protéine de recombinaison. Une fois que vous obtenez votre ADN copiée, vous devez décider où vous voulez amplifier votre protéine. Ce sera (habituellement un système prokaryotic (bactérien) ou eukaryotic de levure ou de cellules mammifères). Le choix de votre système décidera dans quel vecteur vous devrez copier votre ADN car il y a de différents instigateurs qui fonctionnent dans E.Coli et d'autres qui travaillent mieux avec de la levure ou les systèmes mammifères.

Ainsi que le système d'expression de protéine vous utilisent ?

 Systèmes pour l'expression de protéine

Systèmes d'Expression de Protéine de Prokaryotic

Les systèmes de recombinaison d'expression de protéine de Prokaryotic ont plusieurs avantages. Ceux-ci incluent la facilité de la culture, et la signification très rapide de croissance de cellules que vous ne devrez pas attendre longtemps pour obtenir la protéine des systèmes bactériens une fois que vous copiez votre ADN. L'expression peut être induite facilement dans les systèmes bactériens d'expression de protéine en utilisant IPTG. En outre, la purification est tout à fait simple dans les systèmes prokaryotic d'expression et il y a une pléthore de kits commerciaux disponibles pour l'expression de recombinaison de protéine.

D'autre part, si vous devez utiliser vos protéines pour des études fonctionnelles ou enzymatiques les systèmes prokaryotic sont un problème pendant que la plupart des protéines deviennent insolubles dans des corps d'inclusion et sont très difficiles à récupérer en tant que protéines fonctionnelles. En outre, les la plupart si non toutes les modifications poteau-de translation ne sont pas ajoutées par les bactéries et donc votre protéine d'intérêt peuvent ne pas être fonctionnelles. Les études enzymatiques peuvent être ainsi stériles.

Systèmes d'Expression d'Eukaryotic

Les gènes d'Eukaryotic ne sont pas vraiment “à la maison” en cellules prokaryotic, même lorsqu'ils sont exprimés sous la commande des vecteurs prokaryotic.  Une raison est que les cellules de E. coli fréquemment identifient les produits de protéine des gènes eukaryotic copiés comme étrangers et les détruisent.  Un autre est que les prokaryotes n'effectuent pas les mêmes genres de modification de posttranslational que les eukaryotes .  Par exemple, une protéine qui serait d'habitude couplée aux sucres dans une cellule eukaryotic sera exprimée comme protéine nue quand copié en bactéries.  Ceci peut effectuer une activité’ou une stabilité de la protéine s, ou au moins sa réponse aux anticorps.  Un problème plus sérieux est que l'intérieur d'une cellule bactérienne n'est pas comme favorisant le pliage approprié des protéines eukaryotic comme intérieur d'une cellule eukaryotic.  Fréquemment, le résultat est incorrectement plié, les produits inactifs des gènes copiés. 

Les systèmes d'Eukaryotic pour l'expression de la protéine incluent :

• levure
• cellules mammifères
• cellules de baculovirus (insecte)

Tous ces systèmes sont de grands systèmes eukaryotic pour l'expression des protéines de recombinaison.
Les avantages des systèmes eukaryotic d'expression de protéine incluent le fait que vous pouvez obtenir les niveaux très élevés de l'expression. Il est facile épurer les protéines en utilisant les étiquettes spéciales qui sont incluses dans les vecteurs comprenant le sien, le Myc et d'autres étiquettes.

Vous pouvez même acheter les plasmides qui sécrètent votre protéine dans les medias. Par conséquent vous pouvez continuer à accroître votre système et à rassembler les medias sans lyser vos cellules. Il n'y a aucun corps d'inclusion à s'inquiéter pour et vos protéines ont des modifications poteau-de translation intactes. Ce sont essentiels si vous étudiez la fonction des interactions d'une protéine et/ou de protéine-protéine.

Les inconvénients des systèmes eukaryotic d'expression de protéine incluent le fait que les cellules eukaryotic se développent plus lentes que les cellules prokaryotic.

Vecteurs d'expression avec les instigateurs forts

La fonction principale d'un vecteur d'expression est de rapporter le produit d'un gène habituellement, plus le produit le meilleur.  Par conséquent, des vecteurs d'expression sont d'habitude équipés des instigateurs très forts ; le raisonnement est que plus est produit mRNA, plus le produit de protéine sera fait.
Un tel instigateur fort est l'instigateur de trp (operon de tryptophane).  Il forme la base pour plusieurs vecteurs d'expression, y compris ptrpL1.  Il fait suivi une région du trp promoter/operator, d'un accepteur de ribosome, et peut être utilisé directement comme vecteur d'expression en insérant un gène étranger dans le site de ClaI. Alternativement, la région de commande de trp peut être rendue “portative” en le découpant avec ClaI et HindIII et en l'insérant devant un gène à exprimer en un autre vecteur

Vecteurs Induisibles d'Expression

Il est habituellement avantageux de garder un gène copié represed jusqu'à ce que nous soyons prêts à l'exprimer.  Une raison est que les protéines eukaryotic produites en grande quantité dans les bactéries peuvent être toxiques.  Même si ces protéines ne sont pas réellement toxiques, elles peuvent augmentent jusqu'à de grands niveaux d'Auch qu'elles gênent la croissance bactérienne.  Dans l'un ou l'autre cas, si on permettait au le gène copié de rester allumé constamment, les bactéries soutenant le gène ne deviendraient jamais une assez grande concentration pour produire des quantités signicatives de produit de protéine.  La solution est de maintenir le gène copié arrêté en le plaçant en aval de un instigateur induisible qui peut être arrêté.
L'instigateur de laque est induisible dans une certaine mesure, vraisemblablement restant hors fonction jusqu'à stimulé par l'isopropylthiogalactoside synthétique d'inducteur (IPTG).  Cependant, la répression provoquée par le répresseur de laque est inachevée, et une certaine expression du gène copié sera observée même en l'absence de l'inducteur.  L'one-way autour de ce problème doit exprimer notre gène en plasmide ou phagemid qui porte son propre gène de lacI, comme le fait les pBS.  Le répresseur excessif a produit par telles subsistances d'un vecteur notre gène copié arrêté jusqu'à ce que nous soyons prêts à l'induire avec IPTG.
Une autre stratégie est d'utiliser un instigateur étroitement commandé en tant qu' λ instigateur bactériophage PL. Des vecteurs d'expression avec ce système de promoter/operator sont copiés dans des cellules hôtes soutenant un gène λ température-sensible de répresseur (c1857).  Aussi longtemps que nous maintenons la température de ces cellules relativement basse (32°C), le répresseur fonctionne, et aucune expression ne a lieu.  Cependant, quand nous soulevons la température au niveau nonpermissive (42ºC), le répresseur température-sensible peuvent plus ne fonctionner et le gène copié est induit.

Vecteurs d'expression qui produisent des protéines de fusion

Quand la plupart des vecteurs d'expression fonctionnent, ils produisent des protéines de fusion.  Ceci pourrait d'abord sembler un inconvénient parce que le produit naturel du gène inséré n'est pas fait.  Cependant, les acides aminés supplémentaires sur la protéine de fusion peuvent être d'un grand secours en épurant le produit de protéine.

Considérez les vecteurs d'expression d'oligo-histidine, dont un a les pTrcHis de marque de fabrique.  Ceux-ci ont un ordre court juste d'amont du site multiple de clonage qui encode un bout droit de six histidines.  Ainsi, une protéine exprimée en un tel vecteur sera une protéine de fusion avec six histidines à son extrémité aminée.  Pourquoi voudrions-nous attacher six histidines à notre protéine ?  les régions d'Oligo-histidine comme ceci ont une affinité élevée pour des métaux comme le nickel, ainsi nous pouvons épurer les protéines qui ont de telles régions en utilisant la chromatographie d'affinité de nickel.  La beauté de cette méthode est sa simplicité et vitesse.  Après que les bactéries aient fait la protéine de fusion, nous les lysons simplement, ajoutons l'extrait bactérien de srude à une colonne d'affinité de nickel, effaçons toutes les protéines non liées, puis libérons la protéine de fusion avec de l'histidine ou un imidazol appelé analogique d'histidine.  Ce procédé nous permet de moissonner essentiellement la fusion pure dans seulement une étape.  C'est possible parce que très peu si des protéines normales ont des régions d'oligo-histidine, ainsi notre protéine de fusion est essentiellement le seul qui lie à la colonne.

Ce qui si nous voulons notre sans protéines de l'étiquette d'oligo-histidine ? 

Les créateurs de ces vecteurs ont pensivement fourni une voie de la retirer.  Juste avant le site multiple de clonage, il y a une région de codage pour un bout droit des acides aminés identifiés par l'enterokinase protéolytique d'enzymes.  Ainsi nous pouvons employer l'enterokinase pour fendre la protéine de fusion dans deux parts :  l'étiquette d'oligo-histidine et la protéine que nous voulons. Le site identifié par enterokinase est très rare, et la chance qu'elle existe en notre protéine est non significative.  Ainsi, notre protéine ne devrait pas être coupée vers le haut de pendant que nous retirons son étiquette d'oligo-histidine.  Si nous voulons, nous pouvons exécuter la protéine enterokinase-fendue par la colonne de nickel une fois de plus pour séparer les fragments d'oligo-hisitidine de la protéine d'intérêt.

λ les bactériophages ont également servi de base aux vecteurs d'expression ;  on conçu spécifiquement à cette fin est λgt11.  Ce bactériophage contient une région de commande de laque suivie du gène de lacZ.  Les sites de clonage sont situés dans le gène de lacZ, ainsi les produits d'un gène inséré dans ce vecteur seront des protéines de fusion avec une amorce de B-galactosidase.
Le vecteur gt11 λd'expression est devenu un véhicule populaire pour faire et protéger des bibliothèques d'ADN.  λgt11 nous permet d'interviewer un groupe de copie directement pour l'expression de la protéine droite.  Les ingrédients principaux exigés pour ce procédé sont bibliothèque d'ADN dans λgt11 et un antisérum dirigé contre la protéine d'intérêt.
Nous plaquons nos λ bactériophages avec de diverses insertions d'ADN et épongeons les protéines libérées par chaque clone sur un support tel que la nitrocellulose.  Une fois que nous avons transféré les protéines à partir de chaque plaque à la nitrocellulose, nous sondons avec notre antisérum.  Ensuite, nous recherchons l'anticorps lié à la protéine d'une plaque particulière, en utilisant la protéine étiquetée A de Staphylococcus aureus.  Cette protéine lie étroitement à l'anticorps et étiquette la tache correspondante sur la nitrocellulose.  Nous détectons cette étiquette par l'autoradiographie ou par phosphorimaging, puis allons à notre plat principal et sélectionnons la plaque correspondante.  Notez que nous détectent une protéine de fusion, pas la protéine d'intérêt elle-même.  En outre, il n'importe pas si nous avons copié une ADN entière ou pas.  Notre antisérum est un mélange des anticorps qui réagiront avec plusieurs différentes parties de notre protéine, tellement même un gène partiel fera, aussi longtemps que sa région de codage est copiée dans la même trame d'orientation et de lecture que la région de codage de B-galactosidase.

Pour une revue de recombinaison rapide d'expression de protéine voyez :

Systèmes de recombinaison de Protéine

Référence © Moléculaire 2006 De Copyright