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Hybridation de membrane pour protéger une bibliothèque

Bibliothèques de criblage en utilisant l'hybridation de membrane

Dans les conditions de la température et de la concentration en ion trouvées en cellules, l'ADN est mise à jour dans une structure (deux-échouée) duplex par les obligations d'hydrogène que la forme betwen les bases de A et de T et des bases de G et de C dans chaque brin. Des duplex d'ADN peuvent être dénaturés dans les brins simples en les chauffant, habituellement dans une solution de sel diluée (par exemple, NaCl de 0.01 M), ou en soulevant le pH au-dessus de 11. Si la température est abaissée et la concentration en ion dans la solution est élevée, ou si le pH est abaissé à la réforme de base de paires de neutralité, À et de CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE entre les brins simples complémentaires.

Ce processus va par beaucoup de noms : renaturation, rassociation, hybridation, recuisant. Dans un mélange des acides nucléiques, seulement les brins simples complémentaires (ou les brins contenant des régions complémentaires) rassocieront ; l'ampleur de leur rassociation est pratiquement inchangée par la présence des brins noncomplementary. Une telle hybridation moléculaire peut avoir lieu entre deux brins complémentaires d'ADN ou d'ARN, ou entre un brin d'ARN et un brin d'ADN. Utiliser l'hybridation moléculaire dans la détection de l'ADN spécifique copie, ADN échouée simple des molécules de recombinaison d'ADN est attachée à un support plein, généralement un filtre de nitrocellulose ou une membrane en nylon traitée. Quand une solution contenant les acides nucléiques de single0stranded est séchée sur une telle membrane, les brins simples deviennent irréversiblement liés au support plein en quelque sorte qui des feuilles la plupart des bases disponibles pour l'hybridation à un brin complémentaire. Bien que la chimie si cette attache irréversible n'est pas comprise bonne, le procédé soit très utile. La membrane est alors incubée dans une solution contenant l'ADN simple-échouée radioactivement étiquetée (ou l'ARN) qui est complémentaire à une partie de l'acide nucléique lié à la membrane.

Dans des conditions d'hybridation (près de pH neutre, 40-65 C, NaCl de 0.3-0.6 M), cette sonde étiquetée hybride à l'acide nucléique complémentaire lié à la membrane. N'importe quelle sonde excessive qui n'hybride pas est enlevée, et les hybrides étiquetés sont détectées par l'autoradiographie du filtre. Les virions de recombinaison de lamda actuels dans les plaques d'une pelouse de E. coli sont transférés à une membrane en nylon en plaçant la membrane sur la surface de la boîte de Pétri. Plusieurs des particules virales dans chaque plaque absorbent sur la surface de la membrane, mais beaucoup de virions restent dans les plaques sur la surface de l'agar nutritif dans la boîte de Pétri contenant un grand nombre de lamda individuel copie est reproduits sur la surface de la membrane.

La boîte de Pétri d'original est frigorifiée pour enregistrer la collection de lamda copie. La membrane est alors incubée dans une solution alkaline, qui perturbe les virions, libérant et dénaturant l'ADN encapsulée. La membrane est alors séchée, fixant l'ADN de recombinaison de lamda sur la surface de la membrane. Ensuite, la membrane est incubée avec une sonde radioactive dans des conditions d'hybridation. La sonde d'Unhybridized est enlevée, et le filtre est soumis à l'autoradiographie.

L'appearence d'une tache sur l'autoradiogram indique la présence d'un clone de recombinaison de lamda contenant l'ADN complémentaire à la sonde. La position de la tache sur l'autoradiogram correspond à la position sur la boîte de Pétri initiale où ce clone particulier a formé une plaque. Puisque la boîte de Pétri initiale contient toujours beaucoup de virions d'infectioua dans chaque plaque, des particules virales du clone identifié peuvent être récupérées pour substituer en alignant l'autoradiogram et la boîte de Pétri et en retirant les particules virales du clone correspondant à la tache. Une technique semblable peut être appliquée pour protéger une bibliothèque de plasmide en cellules d'E.coli.