Ordonnancement de Maxam Gilbert

Comment l'ADN est séquencée

ADN ordonnançant suivre la méthode de Maxam-Gilbert

Maxam-Gilbert ordonnançant avec cette méthode d'ADN ordonnançant au lieu de synthétiser l'ADN in vitro et d'arrêter les réactions de synthèse aux programmes finisseurs à chaînes, cette méthode commence par intégral, termine l'ADN étiquetée et la fend avec des réactifs spécifiques de base. Ainsi comment cette méthode fonctionne avec des bases de guanine, mais le même principe s'applique à chacune des quatre bases ; D'abord nous fin-étiquetons un fragment d'ADN que nous voulons ordonnancer.

Ceci peut être 5 ' - ou 3 ' - terminent l'écriture de labels. Ensuite, nous modifions un genre de base. Ici nous employons le sulfate diméthylique (SGD) pour méthyler des guanines. (En fait, ce réactif méthyle également des adenines, mais pas d'une voie cela mène au fendage de brin d'ADN.) Comme dans la méthode à chaînes d'arrêt, nous ne voulons pas affecter chaque guanine, ou nous produirons seulement les fragments minuscules qui ne nous permettront pas de déterminer l'ordre de l'ADN. Par conséquent, nous faisons la méthylation dans les conditions modérées qui mènent à une moyenne de seulement une guanine méthylée par brin d'ADN. Ensuite, nous utilisons un réactif (pipéridine) qui fait deux choses : il entraîne la perte de la base méthylée, puis il casse le circuit principal d'ADN au site de la base perdue (le site apurinic). Dans ce cas-ci, le G au milieu de l'ordre a été méthylé, ainsi la rupture de brin s'est produite là, produisant un trimère étiqueté.

En une autre molécule d'ADN, le premier G ne pourrait pas être méthylé, provoquant un phosphate étiqueté (la base et le sucre seraient détruits dans les fendages chimiques). En conclusion, nous electrophorese les produits et les détectons par l'autoradiographie, juste comme dans la méthode de chaîne-arrêt. Naturellement, nous devons exécuter trois autres réactions qui se fendent les trois aux autres bases. Il y a plusieurs voies de faire ceci. Par exemple, nous pouvons affaiblir les liens de glycoside à l'adénine et à la guanine avec de l'acide ; alors la pipéridine entraînera le depurination et la rupture de brin après tous les deux comme et Gs. Si nous electrophorese ceci réaction d'A + de G près de la réaction de G seulement, nous pouvons obtenir comme par comparaison. De même, l'hydrazine ouvre des boucles de thymine et de cytosine, et la pipéridine peut alors retirer ces bases et casser le brin d'ADN aux sites en résultant d'apyrumidine. En présence du NaCl de 1M, l'hydrazine est spécifique pour la cytosine seulement, ainsi nous pouvons exécuter cette réaction à côté de la réaction de C+T et obtenir les solides totaux par comparaison.

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