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Spectrométrie de masse

Quel est un spectromètre de masse ?

Un spectromètre de masse est basé sur le fait simple que les différents produits chimiques ont les différentes masses, et c'est ce qui détermine quels produits chimiques sont présents dans un échantillon. Il y a beaucoup de types de spectromètres de masse qui analysent non seulement les ions différemment mais produit différents types d'ions ; cependant ils tous utilisent les champs électriques et magnétiques pour changer la voie d'accès des ions d'une manière quelconque.

Pendant la fin des années 1980 et le début des années 90, deux nouvelles méthodes d'ionisation d'échantillon ont fait subir la spectrométrie de masse une révolution dans l'analyse de biopolymère, à savoir ESI 38 et MALDI.39 juste au-dessus il y a d'une décennie, pour la première fois, les techniques spectrométriques de la masse qui pourraient mesurer les masses moléculaires des quantités de femtomole de protéines au-dessus du kDa 100, améliorer souvent que 0.01% exactitude, est devenu largement disponible aux chimistes de protéine. Ces méthodes sont les deux réussies en formant des ions de grands, labiles biomolécules sans dégradation significative de l'analyte. Sont non seulement elles les deux techniques sensibles mais d'ordre prompt – également des spectres de MME. et de MS/MS peuvent être saisis dans des secondes. ESI et MALDI, dus à leurs beaucoup de différences, sont complémentaires et beaucoup de laboratoires de biopolymère ont accès aux deux techniques.

Préparation témoin : électrophorèse 2-Dimensional et spectrométrie de masse

La séparation, l'isolement et la préparation témoin pour les techniques spectrométriques de masse généralement, implique 2-DE (2-Dimenisional électrophorèse), une technique qui peut séparer l'autant d'en tant que 5000 protéines différentes dans une expérience simple. En général, 2-DE est capable de séparer des protéines dans une marge isoélectrique du point (pi) de 3.5–10 et des masses moléculaires s'étendant de 6 au kDa 300, comme pouvant distinguer les protéines modifiées par poteau-translationally (par exemple phosphorylé) et leurs compagnons non-modifiés. Une fois que séparées, les éléments protéiques sont indiquées par des techniques de coloration (par exemple tache argentée, tache fluorescente, bleu de Coomassie) et une fois situé elles peuvent alors être extraites à partir du gel. Des protéines ne peuvent pas facilement être éluées des gels sans utilisation des détergents, qui sont nuisibles à l'analyse spectrométrique de masse ; supplémentaire, les grandes protéines tendent à être hétérogènes (par exemple en raison du glycosylation) et ainsi ne possèdent aucune masse moléculaire qui peut être liée à l'entrée correspondante dans une base de données. Pour surmonter ces obstacles, l'étape d'élution tend à être accomplie après que la protéine ait été assimilée par un lavage aqueux d'acétonitrile d'un morceau excisé de gel. Ceci augmente le rendement de l'extraction 5 et en utilisant une méthode de digestion de dans-gel utilisant la trypsine, qui a été décrite et est largement répandue comme édité ou avec des modifications mineures, produit un échantillon Mme.-compatible à partir dont une identification de protéine peut être faite. L'étape de digestion peut être précédée par une étape facultative de réduction et d'alkylation pour fendre et bloquer les ponts en bisulfure qui existent entre les résidus de cystéine. Des systèmes robotiques ont été développés pour automatiser l'excision des taches de protéine du 2D-gel, pour effectuer la digestion enzymatique ultérieure et pour transférer les échantillons sur MALDI-MS visez les plats pour l'analyse initiale de MME.. Pour beaucoup d'applications, les peptides récupérés des digestions de dans-gel exigent la concentration et la purification avant d'être analysée par spectrométrie de masse particulièrement si ESI est la méthode d'ionisation employée. Liquide à phase renversée de rendement élevé
la chromatographie (CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE SOUS HAUTE PRESSION) est une méthode de réaliser ceci ; une autre méthode comporte l'utilisation matériel de ZipTips (millipore) (extrémités de pipette emballées avec matériel C18) ou de Poros R2 de perfusion (biosystèmes de Perseptive). En dépit de sa acceptation répandue, les limitations de 2-DE incluent l'exclusion des protéines très petites ou très grandes, des protéines très acides ou très de base, aussi bien que les protéines hydrophobes telles que des protéines de membrane. On le pense cela
seulement 20% des protéines gel-chargées peut être visualisé et analysé. D'autres contraintes sont que la quantité d'échantillon qui peut être chargée est limitée entraînant la inobservance de
les basses protéines de concentration et également cela les techniques de coloration le plus généralement utilisés ont des facteurs non linéaires de réponse. Dans la pratique, 2-DE est un processus à forte intensité de main d'oeuvre impliquant les étapes de travail manuel qui procurent l'occasion aux impuretés telles que la kératine de souiller les échantillons. L'un 2-D gel prendra un jour pour se terminer et environ un mois pour une analyse structurale complète par la MME., bien que l'automatisation puisse aider le problème de contamination et accélérer l'analyse dans une certaine mesure.

Techniques alternatives de séparation de protéine

L'alternative, des méthodes Mme.-compatibles de préparation de protéine sont en cours de développement mais unique technologie n'a émergé comme remplacement universel. Ces méthodes visent généralement à connecter l'échantillon de protéine directement aux analyses de MS/MS éliminant de ce fait des étapes longues de préparation témoin et le besoin d'analyse préliminaire de MME.. Mise au point isoélectrique capillaire (CIEF)-MS et la mise au point isoélectrique préparatoire suivis de la chromatographie-Mme. d'exclusion de taille sont des méthodes qui ont étée détaillées comparé avec 2-DE en termes d'effciency de séparation, capacité maximale, précision et robustesse, avec ancien apparaître l'alternative.The plus favorable dirigent l'analyse des mélanges complexes de peptide d'un mélange des protéines en utilisant en ligne, chromatographie liquide à phase renversée de rendement élevé (HPLC)-MS/MS a été utilisé avec succès pendant qu'une alternative à 2DE et à ceci a introduit ensuite la chromatographie multidimensionnelle si une plus grande séparation de peptide est souhaitable avant les analyses de MS/MS. Les exemples de la chromatographie bidimensionnelle incluent l'échange d'anion ou cationique suivi de la chromatographie à phase renversée d'exclusion de CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE SOUS HAUTE PRESSION et de taille suivie de la CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE SOUS HAUTE PRESSION à phase renversée. Une autre, approche alternative a été d'utiliser la micro-extraction en phase solide combinée ainsi que le capillaire electrophoresis(CE) couplé à ESI MS/MS pour l'analyse d'un sommaire tryptique de protéine totale. Cette méthode a eu les moyens la séparation de haute résolution des fragments de peptide permettant l'identification de 80–90% des protéines dans ce complexe particulier de ribosome de levure. L'accouplement des dispositifs microfluidic à la MME. est une autre stratégie qui combine la manipulation et la séparation d'échantillon, aussi bien que se connecter par interface d'une manière ordonnée à l'approche différente de nano-esi-ms analysis.A pour le fractionnement sélectif de protéine et l'identification utilise la technologie de ProteinChip (Ciphergen) qui utilise une méthode extérieure de saisie en utilisant des anticorps ou des surfaces chimiquement modifiées pour capturer les classes spécifiques des protéines qui sont alors analysées par MALDI-MS. Cette technique, connue sous le nom de surface a mis en valeur l'ionisation de désorption de laser (SELDI)-MS35, a le grand potentiel pour la comparaison de la teneur en protéines de différents échantillons.