Procédure de connexion de membre
Procédure de connexion de membre
La composition en acides aminés du peptide est déterminée. Le peptide est hydrolysé en son acide aminé constitutif en le chauffant en HCL de 6 N à 110°C pendant 24 heures. Stanford Moore et William Stein ont prouvé que des acides aminés en hydrolysats peuvent être séparés par la chromatographie d'échange ionique sur des colonnes de polystyrène sulfonaté et être dosés en les réagissant avec de la ninhydrine.
Les acides aminés ont traité cette voie donnent une couleur bleue intense, excepté la praline, qui donne une couleur jaune parce qu'elle contient un groupe d'animés secondaire. La concentration de l'acide aminé dans une solution est proportionnelle à l'absorbance optique de la solution après le chauffage il avec de la ninhydrine. Cette technique peut détecter un microgramme (10nmol) d'un acide aminé, qui est au sujet de la quantité actuelle dans un thumbprint.
Aussi peu qu'un nanogram (pmol 10) d'un acide aminé peut être détecté au moyen de fluorescamine, qui réagit avec le groupe un-aminé d'un produit fortement fluorescent. L'identité de l'acide aminé est indiquée par son volume d'élution, qui en volume de mémoire tampon employé pour éliminer l'acide aminé de la colonne.
Le résidu d'aminé-terminal d'une protéine ou d'un peptide peut être identifié en l'étiquetant avec un composé qui forme un lien covalent stable.
Fluorodinitrobenzene (FDNB) a été la première fois employé à cette fin par Frederick Sanger. Le chlorure de Dabsyl est maintenant utilisé généralement parce qu'il forme les dérivés intensément colorés qui peuvent être détectés avec la sensibilité élevée. Il réagit avec un groupe a-NH2 uncharged pour former un dérivé de sulfonamide qui est stable dans les conditions qui hydrolysent des liens de peptide.
Bien que la méthode de dabsyl pour déterminer le résidu d'aminé-terminal soit sensible et puissante, elle ne peut pas être utilisée à plusieurs reprises sur le même peptide parce que le peptide est totalement dégradé dans l'étape d'acide-hydrolyse. Pehr Edman a conçu une méthode pour étiqueter le résidu d'aminé-terminal et le fendre du peptide sans perturber les liens de peptide entre les autres résidus d'acide aminé. La dégradation d'Edman enlève séquentiellement un résidu à la fois de l'extrémité aminée d'un peptide. L'isothiocyanate phénylique réagit avec le groupe d'animés terminal uncharged du peptide pour former un dérivé de phenylthiocarbamoyl. Puis, dans des conditions acides mildy, un dérivé cyclique de l'acide aminé terminal est libéré, qui laisse un peptide intact raccourci par un acide aminé.
Des analyses des structures de protéine ont été nettement accélérées par le développement des sequenators, qui sont les instruments automatisés pour la détermination de l'ordre d'acide aminé. Dans un sequenator liquid-phase, une couche mince de protéine dans une tasse cylindrique de rotation est soumise à la dégradation d'Edman. Les réactifs et les dissolvants d'extraction sont passés au-dessus du film immobilisé de la protéine, et l'acide PTH-aminé libéré est identifié par la chromatographie liquide à haute pression (également appelée chromatographie liquide, la CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE SOUS HAUTE PRESSION à rendement élevé).
Un cycle de la dégradation d'Edman est effectué en moins de deux heures. Par des dégradations répétées, l'ordre d'acide aminé d'environ cinquante résidus dans une protéine peut être déterminé. Les sequenators en phase gaseux peuvent analyser des quantités de picomole de peptides et de protéines. Cette sensibilité élevée le rend faisable pour analyser l'ordre d'un échantillon de protéine élué d'une bande simple d'un gel de SDS-polyacrylamide.
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