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Station moléculaire de copyright 2007
Le transfert de Southern est une technique baptisée du nom de son inventeur et lotisseur, le biologiste britannique Edwin M. méridional en 1975. Le transfert de Southern est une technique qui permet la détection d'un ordre spécifique d'ADN (gène ou autre) dans un grand, complexe échantillon d'ADN (par exemple ADN cellulaire).
« Avant ACP et jeûnent bon marché ordonnançant a changé notre avis sur l'univers qui est la génétique, la tache méridionale était cheval de labour universel. Il n'y avait pas une expérience dans la génétique moléculaire qui n'a pas à un certain moment utilisé une tache méridionale. C'est toujours un outil utile et vous devez savoir à son sujet de sorte que vous puissiez interpréter des données historiques. »
Diagramme de la technique méridionale de tache. La figure est copyright. Si vous voudriez l'utiliser pour un projet de conférence ou de science, svp contactez-nous pour la permission.
Dans l'étape 1, l'ADN est assimilée avec des ribonucléases de restriction. L'ADN à poids moléculaire élevé est assimilée dans de plus petits fragments.
Dans l'étape 2, L'ADN est alors séparée dehors par taille par l'électrophorèse sur un gel d'agarose.
Dans l'étape 3, une feuille de membrane de nylon ou de nitrocellulose (pourpre) est placée sur le gel d'agarose dans une solution tampon. Ceci est considéré l'étape de éponger ou transférer. De la pression est appliquée même au gel utilisant l'aspiration ou en plaçant une pile de serviettes de papier et un poids sur la membrane et le gel pour assurer même le contact entre le gel et la membrane. Le transfert de mémoire tampon par l'action capillaire à partir d'une région de potentiel d'hautes eaux à une région de potentiel de la basse eau (habituellement papier filtre et tissus de papier) est alors employé pour passer l'ADN du gel à la membrane. Franchement - on utilise habituellement la membrane chargée (pourpre) qui permet à l'ADN de lier avec l'affinité élevée à la membrane par des interactions d'ion entre négativement - ADN chargée et franchement - membrane chargée.
Dans l'étape 4, des membranes de nitrocellulose sont faites cuire au four par exposition aux températures (de °C) 60 à 100. Des membranes en nylon sont exposées au rayonnement UV. Ces étapes sont employées pour assurer la réticulation permanente et covalente de l'ADN actuelle dans les bandes aux membranes.
Dans l'étape 5, la membrane est exposée à une sonde radioactive. Cette sonde est un fragment monocatenaire d'ADN qui a votre ordre d'intérêt que vous voulez détecter. Cette sonde est incubée avec la membrane et permise d'hybrider avec de l'ADN sur la membrane. Les sondes sont habituellement radioactives de sorte qu'elles puissent être détectées sur le film, toutefois de plus nouvelles sondes sont également utilisées qui sont non radioactives comme les colorants fluorescents ou chromogènes. Après hybridation, la sonde non liée excessive est lavée à partir de la membrane, partant de la sonde spécifiquement liée.
Dans l'étape 6, la configuration de l'hybridation est détectée par la visualisation sur le film radiographique par l'autoradiographie dans le cas des sondes radioactives ou fluorescentes, ou par le développement de couleur sur la membrane si une méthode de détection chromogène est utilisée.
(Notes pour étape 3 : Si les grands fragments d'ADN sont présents plus considérablement le kb que 15 dans la taille peut être d'ici là acide dilué depurinated de HCL avant d'éponger qui divisera l'ADN en plus petites parties, de ce fait permettant un transfert plus efficace à partir du gel à la membrane. Si des méthodes alkalines de transfert sont utilisées, le gel d'ADN est placé dans une solution alkaline (contenant typiquement l'hydroxyde de sodium) pour dénaturer l'ADN bicaténaire. La dénaturation dans un environnement alkalin prévoit l'attache améliorée négativement - ADN chargée à a franchement - de la membrane chargée, la sépare dans les brins simples d'ADN pour l'hybridation postérieure à la sonde (voir ci-dessous), et détruit n'importe quel ARN résiduel qui peut encore être présent dans l'ADN.
ACOUSTIQUE : Écoutez une explication méridionale détaillée de tache ! Courtoisie : Institut de recherche de recherche humain national de génome.
Comme mentionné, la tache méridionale est une technique employée pour identifier et localiser les ordres d'ADN qui sont complémentaires à une autre partie d'ADN appelée une sonde.
La séparation sur un gel électrophorétique des ordres ou des fragments de l'ADN genomic ou complémentaire, partiellement assimilés par des ribonucléases, les fragments « sont alors épongées » sur une membrane et permises d'hybrider avec un détail, étiqueté sonde afin de détecter quelles bandes contiennent le fragment ou le gène d'intérêt. La tache méridionale est particulièrement utile en détectant de grandes réarrangements génétiques/suppressions et grandes expansions de répétition de trinucleotide.
Une tache méridionale est une méthode par habitude employée dans la biologie moléculaire pour vérifier la présence d'un ordre d'ADN dans un échantillon d'ADN. Le transfert de Southern combine l'électrophorèse de gel d'agarose pour la séparation de taille de l'ADN avec des méthodes pour transférer l'ADN taille-séparée à une membrane de filtre pour l'hybridation de sonde. D'autres méthodes épongeantes (c.-à-d., tache occidentale, tache nordique, tache du sud-ouest) qui utilisent les principes semblables, mais l'utilisation de l'ARN ou de la protéine, plus tard ont été nommées dans la référence au nom méridional. Car la technique a été eponymously nommée, la tache méridionale devrait être profitée, tandis que les taches nordiques et occidentales ne devraient pas.
Elle est également employée pour déterminer le poids moléculaire d'un fragment de restriction et pour mesurer des quantités relatives dans différents échantillons.
Les taches sont des techniques pour transférer des protéines d'ADN et d'ARN sur un porteur ainsi elles peuvent être séparées, et suivent souvent l'utilisation d'une électrophorèse de gel. La tache méridionale est utilisée pour transférer l'ADN.
L'hybridation de la sonde à un fragment spécifique d'ADN sur la membrane de filtre indique que ce fragment contient l'ordre d'ADN qui est complémentaire à la sonde.
Des taches méridionales sont utilisées dans plusieurs domaines principaux comprenant la découverte et cartographie de gène, études d'évolution et de développement, diagnostics et médecines légales.
Dans des conditions optimales, le transfert de Southern détecte la page du ~ 0.1 de l'ADN d'intérêt
Pour faire 1 litre de la mémoire tampon de 20X SSC, ajoutez ce qui suit :
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