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Protocole de Phosphatase Alkaline de Crevette de SÈVE

La phosphatase alkaline ou la SÈVE de crevette, est une enzyme qui catalyse la dephosphorylation de 5’ phosphates des extrémités dephosphorylating d'ARN ou d'ADN d'acide nucléique.

Notez que les produits de PCR et également des amorces n'ont pas des phosphatases sur leurs extrémités libres, et devez donc être phosphorylé avant le clonage si vous allez utiliser un vecteur De-phosphorylé !

La SÈVE est la température instable sont donc vous peut facilement mettre cette enzyme (comparée au CIP !). La SÈVE est mise hors fonction avec l'incubation du bain d'eau 65°C pendant 15 minutes.

Vous n'obtenez pratiquement aucune réaction. La SÈVE exige au moins mgcl2 de 10mM (mais l'activité enzymatique optimale de la phosphatase alkaline de crevette est à mgcl2 de 20-25mM) et cela fonctionne bien à pH 8.0.

Au pmol du dephosphorylate 1 des extrémités d'ADN

Au pmol du dephosphorylate 1 des extrémités d'ADN (2.5 ug de plasmide de 3 KBS), parce que au 1hr à 37°C que vous avez besoin :

0.1 unité de SÈVE pour les surplombs 5', 0.2 unité pour émoussé et 0.5 unité pour l'excédent 3's'arrête.
L'enzyme vient 1 unité par UL, ainsi être sûr vous peut utiliser les unités approx.0.5 pour 2 ug.

TIP : L'enzyme de SÈVE peut être ajoutée directement au sommaire de restriction ! Ainsi la démarche entière comprenant la digestion d'enzymes de restriction, la dephosphorylation, la inactivation d'enzymes, la ligature ou 5’ fin-étiquetant peut être exécutée dans un tube simple en ajoutant juste les réactifs appropriés. Ceci vous permettra de sauvegarder le temps et d'être efficace !

Phosphatase Alkaline de Dépannage de Crevette de SÈVE ?

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