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Digestion d'Enzymes de Restriction

Enzymes de Restriction

©Station 2006 Moléculaire

L'information sur la façon dont devenir un expert en enzymes de restriction et ADN d'assimilation !

Fond sur des enzymes de restriction

Les enzymes de restriction (ou les ribonucléases de restriction) sont les enzymes qui coupent l'ADN bicaténaire en faisant deux ruptures, une par chacun des circuits principaux de phosphate de la double spirale. L'enzyme fait ceci sans endommager les bases de l'ADN. Bien que l'enzyme casse l'ADN, les obligations chimiques peuvent être reformées par d'autres enzymes connues sous le nom de ligases d'ADN. Par conséquent, des fragments de restriction de l'ADN de différents chromosomes ou gènes peuvent être ligaturés ensemble, fournissant leurs extrémités sont complémentaires.

 

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Utilité des enzymes de restriction dans la biologie moléculaire

Le fait que l'ADN pourrait être manipulée et différents morceaux d'ADN pourraient ne maintenant être épissés ensemble, de nouveaux domaines de recherche ouverts jamais avant imaginé. Plusieurs des méthodes dans la biologie moléculaire se fondent aujourd'hui sur des enzymes de restriction. la "restriction" est dérivée du fait que ces enzymes ont été initally découvertes dans E. coli qui a semblé limiter l'infection des bactériophages spécifiques ("virus" des bactéries). On le croit que des enzymes de restriction sont un mécanisme de défense de centre serveur évolué par des bactéries et d'autres organizations pour résister à des infections virales, et pour aider avec l'élimination des ordres viraux.

En 1978, le prix Nobel pour la médecine a été attribué à Werner Arber, à Daniel Nathans et à Hamilton Smith pour leur découverte des ribonucléases de restriction, qui mènent au développement des technologies de recombinaison de lc'adn. La première utilisation pratique des enzymes de restriction en science et médecine était la manipulation des bactéries de E. coli pour exprimer l'insuline humaine de recombinaison pour des diabétiques.

Manipulant et en utilisant des enzymes de restriction

Une unité de l'activité enzymatique de restriction est définie par la quantité d'enzyme de restrition exigée pour couper 1 microgramme d'ADN du bactériophage lambda à l'accomplissement dans un moment de 1 heure.

Les analyses se sont développées par le constructeur des enzymes sont le plus susceptibles faites en utilisant l'ADN fortement purifiée (c.-à-d. les plasmides ou l'ADN bactériophage de lambda) comme substrat, et l'analyse conditionne qui produisent les meilleurs résultats avec leur préparation particulière. Souvent les conditions de laboratoire ne sont pas comme idéaux, et un léger excès d'enzyme ou d'une plus longue période d'incubation est employé pour aider à assurer la digestion complète.

Il y a beaucoup de solutions tampon 'universelles 'd'enzymes qui fonctionneront avec une variété d'enzymes, mais souvent elles ne répondent pas aux exigences les plus efficaces pour aucune une enzyme. Puisque les mémoires tampons universelles ne sont pas comme efficaces, nous ne recommandons pas leur utilisation courante dans le laboratoire (particulièrement pour DNAs genomic complexe ; les sommaires de DNAs genomic complexe sont habituellement aux concentrations élevées en ADN qui empêcheront l'enzyme ; aussi, les préparations relativement brutes d'ADN peuvent contenir des inhibiteurs qui a besoin de plus temps d'incubation d'ard d'enzymes d'unités de plus longs pour la digestion complète). Il est toujours le meilleur pour utiliser les conditions recommandés de l'analyse du constructeur pour la digestion de restricition. Quelques constructeurs ont copié les enzymes qui ont des conditions très différentes d'autres versions de la même enzyme, ainsi contrôlent avant utilisation. Des concentrations en enzymes sont toujours données du côté du tube d'enzymes. Des enzymes de restriction utilisées dans le laboratoire sont toujours enregistrées à -20 degrés C (dans une base de glycérol), et devraient être gardées comme de près de -20 degrés C comme possibles de prolonger la vie de l'enzyme. En installant des sommaires, apportez le tube de réaction au congélateur d'enzymes dans une position de glace ; retirez le tube d'enzymes du congélateur et gardez le tube sur la glace tout en travaillant avec de l'enzyme. Renvoyez immédiatement le tube au congélateur une fois terminé. Utilisez pipetmen indiqué pour des enzymes de restriction seulement et utilisent toujours une extrémité pipetman fraîche en éliminant l'enzyme du tube courant.

Extrémités sur l'utilisation d'enzymes de restriction

• Tout le constructeur des enzymes de restriction fournissent les mémoires tampons spécifiques les enzymes, et ceux-ci devraient être enregistrés dans le congélateur de -20°C. Des enzymes de restriction devraient également être enregistrées à -20°C.
• Ne composez jamais les sommaires de restriction avec de l'enzyme de restriction composant plus de 1/10 de volume final. C'est dû au fait que les protéines enzymatiques de restriction sont enregistrées en glycérol. Aux concentrations au-dessus de 10%, le glycérol non seulement empêche la digestion mais également peut causer tiennent le premier rôle l'activité - menant aux coupes anormales et non spécifiques de l'ADN.
• Installez un sommaire de commande en utilisant des enzymes de restriction. Ceci vous aide à savoir si l'enzyme fonctionne correctement et vous établissez la réaction bien. Utilisez une ADN de plasmide qui produit des configurations connues de fragmentation.
• En préparant de doubles sommaires d'enzymes, déterminez la teneur en sel des mémoires tampons. Conduisez la digestion de restriction en utilisant l'enzyme avec les conditions inférieures de sel D'ABORD, puis utilisez la deuxième enzyme en ajustant la mémoire tampon du tube de réaction sur la deuxième concentration optimale en sel.
• Les préparations d'ADN peuvent avoir des impuretés qui peuvent empêcher l'activité de digestion d'enzymes de restriction. Quelques kits d'isolement d'ADN emploient même les solutions tampon élevées d'EDTA pour éluer l'ADN. C'est correct pour la mémoire d'ADN, mais les concentrations élevées de l'EDTA peuvent empêcher la digestion de restriction. PCR purifient votre ADN et s'éluent avec TE ou arrosent si votre activité enzymatique est empêchée mais vos regards d'ADN bien. Vous pourriez également ajouter Mg2+ à la réaction et voir si ce des aides aussi.
• Si vous ne pouvez pas obtenir la digestion complète de restriction de votre ADN après avoir ajouté l'enzyme supplémentaire, installez un nouveau sommaire et ajoutez le spermidine à une concentration finale de 2 millimètres.

Digestion d'enzymes de restriction de l'ADN

Analytique contre des digestions préparatoires d'enzymes de restriction

Habituellement des digestions d'ADN sont conduites à l'UL 25 - 50 (microlitres), quand vous voulez juste contrôler ou analyser votre ADN. Celles-ci s'appellent les digestions analytiques d'enzymes de restriction.

On peut assimiler 0.25 à 2 ug (microgrammes) pour les préparations analytiques. C'est parce que sur un minigel d'agarose (30ml), on peut visualiser approximativement le 05ug (50 NG, les nanograms) par bande. La visualisation d'une bande dépend de la longueur de l'ADN et de la quantité de présent d'ADN. En général, plus l'ADN actuelle dans la bande est longue, le plus facile est sera de voir.

Digestions d'ADN de beaucoup de microgrammes et volumes plus élevés de 50 - l'UL 500 (microlitres) ou plus sont préparatoires, signifiant que vous préparez des fragments d'ADN pour la purification ultérieure et les copiez.

Digestion de restriction de protocole d'ADN

Recette pour la digestion d'enzymes de restriction :

Analytique

Vous pourriez ajouter Mg2+ à la réaction de digestion (sous forme de MgCl) si vous utilisez un grand volume d'ADN. Vous devriez faire ceci particulièrement si la mémoire tampon vous éluiez votre ADN en EDTA contenu. C'est parce que si "X" est grand, IE > 20ul le volume, vous peut devoir ajouter des grippages d'EDTA de magnésium à 4 moles de magnésium pour chaque mole d'EDTA. Ainsi, l'ADN dans une solution (milimolar) de 1 millimètre d'EDTA liera 4mM de magnésium. Un bon principe de base doit ajouter 1 1ul de 10mM MgCl à chaque 20ul de l'ADN.

Préparatoire

Incubez à 37°C pendant 1 - 3 heures.

1 unité est assez d'enzyme à l'ADN d'ug digest1 au moins en 1 heure. Assimilation pendant 3 heures vous pourriez assimiler des montants plus élevés d'ADN. Car vous ajoutez 10-20 unités d'enzyme, vous pourriez même assimiler 10ug de l'ADN en 1 heure ! Les enzymes sont chères ne les gaspillent pas inutilement !

Notes sur l'utilisation d'enzymes :

• Maintenez les enzymes froides.
• Gardez toujours les enzymes de restriction sur la glace !
• Réduisez au minimum le temps où vous avez des enzymes de restriction sur la glace. Vous pouvez faire ceci facilement en achetant un cadre froid (qui est fondamentalement un bloc de métal que vous gardez vos enzymes dedans)

Références :

Sambrook, J., Fritsch, clonage moléculaire d'E.F., et de T. Maniatis.(1989), un manuel de laboratoire. Deuxième édition. Presse Froide de Laboratoire de Port de Ressort. pp 5.3- 5.32.

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