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Protocole d'Isolement d'ADN de Genomic

Choix d'une méthode de purification d'ADN de Genomic

Le but de l'isolement genomic d'ADN dépend de ce qui les applications de l'ADN après l'isolement. La pureté, la source, la quantité et la qualité de l'ADN sont toutes les questions qui doivent être abordées avant l'extraction genomic d'ADN. Une foule entière de différentes méthodes, les technologies et les kits sont disponibles maintenant aux chercheurs pour isoler l'ADN genomic des cellules.

• Quantité d'ADN requise
• Poids moléculaire et taille de l'ADN
• Pureté de l'ADN requise
• Applications descendant de l'ADN
• Temps disponible
• Facilité de technique ou de méthode d'extraction d'ADN
• Dépenses ou argent disponible

Les méthodes spécifiques du pays ou de laboratoire d'ADN d'extraction souvent tout à fait bien pour les laboratoires qui les ont développés et utilisent régulièrement ces protocoles.

Notez cependant l'étalonnage de manque de ces méthodes. En outre le rendement d'ADN et la qualité d'ADN ne sont pas toujours reproductibles d'une personne au prochain.

Fond sur l'isolement et la purification d'ADN de Genomic

Généralement, toutes les méthodes impliquent l'interruption et le lysis des cellules. Ceci est suivi parfois du déplacement de l'ARN (par RNAses, sel ou d'autres méthodes). Choisissant comprenant quelle méthode utiliser dépendra de beaucoup de facteurs de sélection :

L'ADN est isolée dans des protéines par plusieurs méthodes comprenant la digestion des protéines par la protéinase K. Proteins d'enzymes sont retirées ultérieurement le salage, l'extraction organique, ou en liant de l'ADN à un support en phase solide (tel qu'une technologie de colonne ou de silice d'échange anionique).

L'ADN est finalement récupérée par la précipitation d'éthanol ou la précipitation d'isopropanol.

En général, la séparation de l'ADN des cellules et des composants cellulaires peuvent être divisés en quatre étapes :

1. Interruption de cellules
2. Lysis de cellule
3. Déplacement des protéines et des contaminants
4. Reprise de l'ADN

Dans quelques protocoles genomic d'isolement d'ADN, les étapes 1 et 2 sont combinées.

Les matériaux ont eu besoin pour la méthode d'extraction d'ADN de Genomic

Mémoire tampon de lysis pour la recette d'ADN de Genomic :

50 millimètres Tris-HCl, pH 8.0
EDTA de 50mM
1% SDS
NaCl de 10mM

Méthode de purification d'ADN de Genomic des échantillons de tissu

1. Choisissez l'échantillon de tissu pour utiliser. Assurez-vous que l'échantillon est correctement préparé et gardé sur la glace. Si l'échantillon ne sera pas utilisé immédiatement pour l'extraction d'ADN, alors les échantillons doivent être enregistrés correctement dans le congélateur de -20°C pour à plus long terme ou le 4°C pour l'utilisation courte de limite (peu d'heures).
2. Coupez le tissu en plus petits morceaux. Pour le foie ou tout autre tissu mou, ne vous inquiétez pas de faire les morceaux fins.
3. Ajoutez le tissu à un mortier préréfrigéré (de glace sèche), ajoutez immédiatement le N2 d'azote liquide.
4. Commencez à rectifier le tissu dans la poudre fine. Ajoutez plus de Liq. N2 comme nécessaire. Transférez la poudre froide au tube de 30 ml, congé débouché ainsi le N2 peut s'évaporer.
5. Ajoutez 9 ml de mémoire tampon par-chauffée du lysis (5°C) et resuspendez doucement la poudre.
6. Ajoutez l'UL 100 de 10mg/ml de la protéinase K, (c.-à-d., 100 ug en solution). Incubez 55°C pendant 1-18 heures. Mélangez doucement périodiquement. Ajoutez l'UL 100 de la protéinase K après des 2 premières heures, optimum : 3 heures ajoutant la protéinase K à 1.5 heure.
7. Échantillon de festin très doucement. Additionnez 1 ml de 3M Na0Ac (pH 4.0), 10 ml du phénol (55°C) chaud, mélangez doucement mais throughly pendant 5-10 minutes.
8. Centrifugez les échantillons pendant 15 minutes.
9. Répétez l'extraction chaude de phénol.
10. Extrait avec du phénol égal du volume (10ml) : CIA (pièce de 1 part phenol:1 CIA : CIA = 23 parts de chloroform:1 d'alcool isoamylique de pièce)
11. Extrait avec l'extraction égale du volume (10ml) CIA
12. La phase supérieure devrait être relativement claire, si elle contient de grands chiffons blancs, ou est très laiteuse, (i) incubent à 68°C 15 mn, et à extrait de re-phénol, (ii) début encore, mais incubent plus longtemps avec P-K.
13. Phase supérieure de transfert au nouveau tube. Ajoutez 2 volumes d'éthanol froid et mélangez doucement (sel : Na0Ac est déjà en solution). En utilisant un crochet et un pasteur scellé introduisez à la pipette le traitement différé hors de l'ADN. Effacez l'éthanol excessif du côté des tubes. Resuspendez dans 2-5 mls de TE. Assurez-vous que l'ADN est complètement dissoute (congé sur le dispositif trembleur doux.)
14. Ajoutez le mélange de RNase (100 ug de RNase A, 10U de RNaseT1). Incubez 30 37°C minimum. ** vous pourriez ajouter la RNase avant la protéinase K, incubez à 37°C pour 1 heure et puis commencez la digestion de protéinase. Vous pourriez alors sauter l'étape 15 -.
15. Ajoutez 100 ug de protéinase K, les incubae 37°C 30 minutes.
16. Ajoutez 1/10 vol. 3M Na0Ac, extrait de phénol une fois, extrait de Phenol:CIA deux fois, CIA extrait une fois.
17. Ajoutez 2.5 volumes EtOH, mettez dans -20°C 30 minutes. Centrifugez 20 minutes.
18. Lavez bien avec 70%, retirez tout l'etOH. Si vous séchez, pas l'excédent SEC.
19. Resuspendez soigneusement, lentement in1-2mls TE (solution tampon de Tris-EDTA). (1x ou 0.1x).

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