Interactions d'Analyse de Protéine d'ADN

Renseignez-vous sur la façon analyser des interactions d'ADN-PROTÉINE.

Interactions d'Analyse de DNAProtein

Il y a quatre techniques importantes pour analyser des interactions d'ADN-PROTÉINE. Les deux premières techniques (attache de filtre et décalage de mobilité de gel) déterminent si votre ADN agit l'un sur l'autre avec la protéine. Les deux autres techniques (DNase Footprinting et SGD Footprinting) indiquent où le site de cible de l'interaction entre la protéine et l'ADN se trouve sur l'ADN.

Attache de Filtre

Des filtres de membrane de nitrocellulose sont généralement utilisés pour stériliser par filtration des solutions. Les filtres de nitrocellulose peuvent lier l'ADN, mais seulement dans certaines conditions. L'ADN de Singlestranded lie aisément à la nitrocellulose, mais l'ADN échouée par double par elle-même pas . D'autre part la protéine lie, et si une protéine est liée à l'ADN bicaténaire le complexe protéine-ADN liera. Veuillez se référer à l'article obligatoire d'analyse de filtre de nitrocellulose pour plus d'information.

Gélifiez Le Décalage de Mobilité

Afin de mesurer des interactions d'ADN-PROTÉINE cette technique se fonde sur le fait simple qu'une petite ADN a une mobilité beaucoup plus élevée dans l'électrophorèse de gel que la même ADN quand elle doit bondir à une protéine. Nous pouvons donc étiqueter un fragment d'ADN échoué par double de tri, puis le mélangeons à une protéine, et electrophorese le complexe. Alors nous soumettons le gel dans l'autoradiographie pour détecter les espèces étiquetées. La petite taille de l'ADN est importante dans cette analyse. Si un gène entier étaient utilisés sa mobilité serait déjà très basse, et il serait difficile détecter le décalage de mobilité provoqué par l'attache de protéine. Par conséquent nous devons savoir approximativement où la protéine lie à l'ADN ainsi nous pouvons préparer un fragment court de restriction, ou même un oligonucléotide bicaténaire synthétique qui contiendra le site de cible pour la protéine, mais peu autrement.

DNase Footprinting

Une fois que nous savons qu'une protéine lie à une ADN donnée nous pouvons utiliser footprinting pour découvrir où le site de cible se trouve sur l'ADN. La DNase footprinting se fonde sur le fait qu'une protéine, en liant à l'ADN, couvre l'accepteur et ainsi le protège contre l'attaque par Dnase. Dans ce sens elle laisse une "empreinte de pas" sur l'ADN. La première étape dans une expérience footprinting est fin-étiquettent l'ADN. Nous pouvons étiqueter l'un ou l'autre brin, mais seulement un par expérience. Ensuite, nous lions la protéine à l'ADN. Alors nous traitons le complexe d'ADN-PROTÉINE avec de la DNase I dans des conditions modérées (DNase très petite), de sorte qu'une moyenne seulement d'une coupée se produise par molécule d'ADN. Ensuite, nous enlevons la protéine de l'ADN, séparons les brins d'ADN, et electrophorese les fragments résultants sur un polyacylamide de haute résolution gélifient à côté des repères de taille. Les fragments résulteront de l'autre extrémité de l'ADN aussi bien, mais nous ne les détecterons pas parce qu'ils sont non étiquetés. Nous incluons toujours une commande avec de l'ADN seule (aucune protéine), et utilisons habituellement plus d'une concentration en protéine ainsi nous pouvons voir par la disparition progressive des bandes dans la région d'empreinte de pas que la protection de l'ADN dépend de la concentration de la protéine ajoutée. L'empreinte de pas représente la région de l'ADN protégée par la protéine, et nous indique donc où la protéine lie.

SGD Footprinting

La DNase footprinting donne une bonne idée de l'emplacement de l'accepteur pour la protéine, mais la DNase est une macromolécule et est donc un instrument plutôt émoussé pour sonder les détails fins de l'accepteur. Ce qui signifie, ce là peut être des lacunes dans l'interaction entre la protéine et l'ADN dans laquelle la DNase ne s'adapterait pas et donc ne détecterait pas. D'ailleurs, les protéines obligatoires d'ADN perturbent fréquemment l'ADN dans la région obligatoire, tordant la double spirale. Ces perturbations sont intéressantes, mais ne sont pas généralement détectées par Dnase footprinting parce que la protéine maintient la DNase partie. Pour faire footprinting plus détaillé, nous avons besoin d'une plus petite molécule qui peut s'adapter dans les recoins et les fentes de l'ADN-PROTÉINE complexe et indiquons plus des subtilités de l'interaction. Un outil préféré pour ce travail est le dimethylsulfate de méthylation d'agent (SGD).

Avec de la SGD footprinting nous commençons de la même manière qu'en DNase footprinting, fin-en étiquetant l'ADN et l'attache la protéine. Alors nous méthylons le complexe d'ADN-PROTÉINE avec de la SGD, en utilisant un traitement doux de sorte qu'en moyenne seulement une méthylation se produise même par molécule d'ADN. Ensuite, nous délogeons la protéine, et préparons l'ADN avec du réactif qui élimine les purines méthylées, créant les sites apurinic (deoxyriboses sans bases) sur l'ADN. Alors nous cassons l'ADN à ces sites apurinic. Ces réactions sont identiques que l'ADN de Maxam-Gilbert ordonnançant des réactions. Enfin nous electrophorese les fragments et autoradiograph d'ADN le gel pour détecter l'ADN étiquetée se réunit. Chaque bande termine à côté d'un nucléotide qui a été méthylé et ainsi non protégé par la protéine.

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