Empreinte d'ADN

Fond sur l'empreinte d'ADN

L'empreinte de DNase est une méthode de biologie moléculaire qui permet la détection des interactions d'ADN-protéine en exploitant la propriété qu'une protéine agissant l'un sur l'autre avec de l'ADN protégera l'ADN à ce site d'interaction contre la digestion de restriction ou le fendage enzymatique de dnaase. Un fragment de restriction d'ADN qui contient l'accepteur spécifique est étiqueté à une extrémité, habituellement avec 32P et utilisé pour l'empreinte.

On permet à la protéine et l'ADN d'hybrider et lier ensemble.

L'empreinte d'ADN utilise la DNase I d'enzymes ou la nucléase I d'acide désoxyribonucléique afin d'assimiler ou couper loin librement (ou étiqueté) l'ADN radioactive laissant l'ADN liée aux protéines protégée. Les fragments de restriction d'ADN sont traités légèrement avec de la DNase I, qui fait les ruptures à un fil (entailles) dans l'ADN. Un peu d'enzyme est utilisé tels qu'il y a une moyenne de moins de 1 entaille/brin. La réaction est alors arrêtée, l'ADN est dénaturée, et le mélange est fonctionné au polyacrylamide de dénaturisation ordonnançant le gel. Ces fragments séparés par l'électrophorèse de gel sont exposés pour détecter la zone protégée d'ADN en analysant la configuration de fendage de bande sur le gel.

La configuration de fendage de l'ADN en l'absence d'une protéine obligatoire d'ADN, typiquement désignée sous le nom de l'ADN libre, est comparée à la configuration de fendage de l'ADN en présence d'une protéine obligatoire d'ADN. Si la protéine lie l'ADN, l'accepteur est protégé contre le fendage enzymatique. Cette protection aura comme conséquence une zone claire sur le gel qui désigné sous le nom de la « empreinte de pas ».

En variant la concentration de la protéine ADN-contraignante, l'affinité obligatoire de la protéine peut être estimée selon la concentration minimum de la protéine à laquelle on observe une empreinte de pas.

Recettes de mémoire tampon d'empreinte de DNase

Recette obligatoire de mémoire tampon d'empreinte de DNase

2X sans KCl/pour 10mls :

quantité : [finale]
Tris-HCL pH7.6 : UL 500 de 1M : 50 millimètres
Mgcl2 : 125ul de 1M : 12.5mM
EDTA : UL 2 de 0.5M : 1mM
Glycérol : 2 mls : 20%
DTT : UL 10 de 1M : 1 millimètre

Mémoire tampon obligatoire (mémoire tampon de décalage de gel)

5X sans KCL
[finale] : ingrédient
20% : gylerol
5mM : Mgcl2
2.5mM : EDTA
2.5mM : DTT
250mM : NaCl
50mM : Tris-HCL, pH 7.5
0.25mg/ml : poly (Di-C.C) poly (Di-C.C)

Mémoire tampon de Ca/Mg

Pour 10mls
CaCl2 : UL 50 de 1M : 5 millimètres
Mgcl2 : UL 100 de 1M : 10 millimètres

Solution de chargement
0.1 M : NaOH : formamid (1 : 2 v/v)
0.1% : cyanol de xylène
0.1% : bleu de bromophénol

Arrêtez la mémoire tampon
10mls
NaCl : UL 400 de 5M : 200 millimètres
EDTA : UL 600 de 0.5M : 30 millimètres
SDS : 1 10%:1% de ml

TEBe (Tris-EDTA-Bêta mercap.)
Tris-HCL, UL de 7.6:500 de pH de 1 M : 50 millimètres
EDTA : 2ul de 0.5 M : 1 millimètre
Bêta-mercaptoéthanol : UL 10 : 15mM

mémoire tampon de 10 x K
pour 1 ml
UL de 7.5:100 de Tris-HCL pH de 1 M : 100 millimètres
Mgcl2 : UL 100 de 1 M : 100mM
DTT : UL 50 de 1M : 50 millimètres
dH2O : UL 750

Protocole d'empreinte de DNase

L'ADN utilisée contient habituellement l'accepteur de votre protéine d'intérêt. L'ADN est purifiée, puis assimilée avec des fragments de restriction pour être d'une taille d'appopriate. Le fragment d'ADN est étiqueté sur une extrémité (accepteur > point d'ébullition 25 d'extrémité).

Une écriture de labels de brin peut accomplised par :

isolant le fragment avec des enzymes de restriction contenant ' surplomb 5, étiquetant avec Klenow et le nucléotide chaud approprié. Puis sommaire avec de l'enzyme qui retire une extrémité.
l'isolement d'un fragment assimilé avec de l'enzyme de restriction qui crée 5 ' et surplomb les 3 ' terminez, étiquetant avec Klenow étiquettera seulement 5 le '.
Comme dans « a » mais avec de la toute enzyme et employer le polynucléotide kinase pour étiqueter ' extrémité 3 (kinase) et l'assimilation outre d'une des extrémités avec de la deuxième (troisième) enzyme de restriction.
(RAPPEL : si étiquetant avec Klenow, à la fin de la réaction ajoutez un excès du nucléotide froid du même nucléotide qui est étiqueté (c.-à-d. si vous utilisez dCTP32, ajoutez le dCTP à l'extrémité) pour s'assurer toutes les extrémités sont complétés également.

Pour des fragments de Klenow, 0.3ug apportent l'UL jusqu'à 100 dans TE, mise à mort Klenow de la chaleur au °C 68 pendant 10 minutes.

ÉCRITURE DE LABELS avec ' surplomb un 5

Échantillon RXN : 15 NG sont besoin de chaque réaction. Si faisant la sonde pour beaucoup de réactions augmentez JUSTE la quantité d'ADN jusqu'à 300 ngs.
15ng : Fragment d'ADN
UL 2 : mémoire tampon de 10x K
UL 5 : 32P UM 10 uCi/ul du dCTP 3.33
UL 2 : 2mM @ DA, dTTP de dg
1 UL : Klenow
20 volumes finaux d'UL, 37°C 30 mn.
--ajoutez 1 dNTP de l'UL 10mM, 5 la minute @ 37°C.

--ajoutez 80 l'UL TE. 68°C 15 minutes, a mis en fonction la glace.
--Colonne de la rotation G-50 (rotation à environ 2000g)
--AJOUTEZ 1/10 vol. 3M Na0Ac, 2.5 volumes d'EtOH, glacez 30 minutes, (de facultatif si [ADN] est = ou > 3 ng/ul vous pourriez signaler G-50 directement) Microfuge 30 minutes.
--lavez avec 70%
--Sec apportez vers le haut 5ul

Réaction obligatoire pour l'empreinte de DNase

La réaction obligatoire devrait avoir entre le KCl de 10 et de 150mM (plus de sel réduit lier mais spécificité d'augmentations). La concentration typique est 50mM.

Attache d'ADN de protéine :
UL 25 de la mémoire tampon 2X obligatoire sans KCl
5ul de l'ADN unilabeled 3 par ng/ul
UL X du KCl pour égaler 10-150 millimètres de KCl
dH20 pour égaler l'UL 50 sans le volume pour lier protien
1-3 unités d'empreinte de protéine obligatoire d'ADN (ou 10 à 160 ug d'extrait nucléaire brut)

--le mélange doucement, glacent 10 minutes.

SYNCHRONISATION DE SUBSISTANCE À L'ESPRIT,
--AJOUTEZ l'UL 50 de la solution de droite Ca/Mg, 18°C pour 1 minute.
--AJOUTEZ l'UL 3 la DNase RQ1 que diluée (0.05 u/ul dilué dans Tris) INCUBENT 1 minute.
--ARRÊTEZ l'ajout de 90 avec des solutions de l'ARRÊT 37°C,

--vous devriez phénol : Extrait de CIA, et de CIA, et précipité d'éthanol.
--RESUSPENDEZ dans 4ul de solution de chargement.
--Fonctionnez à l'Urée-ADN standard de 5% ordonnançant le gel (considérez le gel de cale) avec des ruelles de chargement d'appopriate telles que l'échelle d'ADN, l'ADN non coupée, et les commandes.

Analysez la configuration d'empreinte.