Clonage d'ADN

Sujets de Forum de Clonage d'ADN

Amorçages
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Clonage Antarctique d'ADN de Phosphatase dnamolecule	03-24-2008 02:03 P.M. par JO18 "	1	354
Colonies Blanches Bleues de Positif de Sélection de Clonage liono	02-20-2008 08:45 AM par Priyanka "	1	588
ADN Émoussée de Clonage d'Extrémité pipette_man	01-23-2008 04:17 AM par le postdock "	2	450
ADN de clonage biojoe	05-16-2007 06:30 P.M. par le biojoe "	0	897
ADN de clonage biojoe	12-31-1969 11:00 P.M. par "	0	82
Clonage de PCR pipette_man	03-28-2008 10:58 AM par serenacorallini "	3	505
Vecteur de clonage aftabac	07-19-2007 04:53 AM par l'aftabac "	0	534
Je recherche un docteur ou n'importe qui qui savent n'importe quoi au sujet du clonage ! ! ! Rocky89	06-04-2008 12:46 AM par Rocky89 "	5	92
Clonage help!!molecular du besoin bsengez	11-12-2007 07:44 P.M. par le bsengez "	4	554
Aucunes Colonies Copiant Les Cellules Compétentes de Vecteur princezz	01-24-2008 03:27 P.M. par le princezz "	2	254
Est-ce que PCR "clonage" ce serait possible ? Ammie	09-17-2007 04:16 P.M. par danfive "	1	302
Clonage de PCR et de Topo kiki06	12-05-2006 09:49 P.M. par kiki06 "	2	1284
problème avec le sommaire de cloning/restriction shurgood	01-24-2008 10:15 P.M. par le shurgood "	0	370

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Insertions de clonage dans des plasmides

Protocole de Clonage d'ADN

Pour vous copier ayez besoin de ce qui suit :

Dirigez l'ADN ou votre construction de plasmide

L'ADN de vecteur peut être :
ADN de vecteur ou de plasmide (qui doit être

Pour vous copier ayez besoin au moins de plusieurs microgrammes (3-5 ou plus) de votre ADN de vecteur.

Insérez ADN (ADN que vous voulez vous insérer dans le plasmide ou le vecteur)

L'ADN d'insertion peut être :
Insertion d'oligonucléotide (oligos avec des moitié-sites de coupe de restriction recuits et phosphorylés avec PNK)
Insertion Produite Par Enzyme de Restriction
Insertion de PCR (PCR avec des sites de coupe d'enzymes de restriction (tout le site est nécessaire !) dans l'extrémité’ 5 de l'amorce)

Si l'insertion que vous voulez copier est moins de 60 le point d'ébullition, vous pouvez commander des oligonucléotides et les recuire ensemble.

Si votre taille d'ADN d'insertion est petite (moins point d'ébullition de 1000), vous n'avez pas besoin théoriquement autant d'ADN que votre vecteur. Si votre taille d'ADN d'insertion est minuscule (point d'ébullition 10-200), vous avez besoin très de peu de cette ADN théoriquement.

En général vous devriez avoir au moins 1 microgramme de commencer l'ADN d'insertion.

Préparer l'ADN de vecteur pour le clonage : Mini-préparation, Midi-préparation, maxi-prep

Nous avons constaté que la voie la plus facile de préparer l'ADN utilise un kit mini-préparation (Qiagen). Nous utilisons plusieurs colonnes pour la même construction d'ADN de vecteur.

Pour chaque colonne nous ajoutons environ 4 ml de bactéries développées par livre (nous ajoutons 2 ml de bouillon de bactéries de livre à un tube d'eppendorf de 2 ml et tournons deux fois = 2 x 2 ml = 4 ml)

Extrémité : Accroissez toujours environ 5 ml de livre -pouce des tubes de faucon de 15 ml, gardent le 1 ml comme les bactéries d'un glycérol stockent figé dans – le congélateur de 80 C.

Comment faire à un glycérol les actions bactériennes pour – le congélateur de 80 C qui gardera pendant des années (vous ne devra jamais strier des plats ou faire les cellules compétentes encore ! – vous sauvegarde temps)

Ajoutez simplement le glycérol de 50% à votre croissance bactérienne livre. Ceci ne doit pas être IE exact si vous êtes laissé avec environ 1 ml de livre bactérienne ajoutez environ 500 uL du glycérol 100% et gelez dans – les 80 C.

Après élution de chaque colonne avec environ 50 uL d'eb (la mémoire tampon d'élution, Qiagen, mémoire tampon de Tris – ne contient pas l'EDTA), nous mettons les éluats tels que nous avons autour 200 uL à 400 uL (ou à 4 – 8 colonnes par construction ou vecteur). C'est donne assez d'ADN commençante de vecteur pour le clonage.

Note: nous avons constaté que l'EDTA dans TE empêche la digestion ultérieure de restriction de l'ADN éluée de mini-préparation et d'autres kits de purification de plasmide.

Préparer l'ADN d'insertion pour le clonage

Insérez l'ADN doit être

Digestion et découpage d'enzymes de restriction votre vecteur de plasmide pour le clonage d'ADN

Le vecteur de plasmide est habituellement coupé.

Ligature d'insertion et de vecteur

Pour ligaturer l'insertion pour diriger, employez 200 NG de vecteur comme guide (les gens utilisent aussi peu que 50 le manuel – de NG N.E.B).

Insérez NG = NG de vecteur
Insérez la taille de vecteur de taille

Par conséquent ligaturer une insertion de 500 points d'ébullition dans un vecteur de 5000 points d'ébullition que vous auriez besoin

Insérez NG = 200 NG X 500
5000

Insérez NG = 20 NG d'insertion requis pour un 1 : 1 ligature

Pour une insertion 3 : 1 ligature de vecteur que vous auriez besoin : 60 NG

Ligature

Vecteur d'ADN    des uL X 200 NG
Insertion d'uL     de Y (NG calculé)
2 mémoire tampon des uL 10 X
1 ligase NEB d'ADN des uL T4
à 20 uL     H20

total de 20   uL

Prenez 5 uL de ligature et ajoutez à 100 uL des cellules Invitrogen d'alpha de CAD 5
(ok d'efficacité de Subcloning, un tiré mieux, efficacité mieux pour – des ligatures dures mais cher maximum).

Chauffez Le Choc
Ajoutez 250 uL de SOC aux cellules compétentes

Plaquez la quantité ENTIÈRE du plat.

Accroissez l'overnite à 37 C

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Indiquez : Taille de vecteur : point d'ébullition
Indiquez : Taille d'insertion : point d'ébullition
Taux : (moles d'ADN d'insertion par mole de l'ADN de vecteur)

Pour le NG d'ADN de vecteur, ajoutent NG d'ADN d'insertion.

Bioinformatics, Protocoles, Protéine Proteomics d'ARN d'ADN

Stations Intracellulaires