Transfection de cellules

La transfection décrit l'introduction du matériel étranger dans les cellules eucaryotiques utilisant un vecteur de virus ou des autres moyens de transfert.

La transfection de limite pour des méthodes non viral est la plus employée souvent dans la référence aux cellules mammifères, alors que la transformation de limite est préférée pour décrire le transfert non viral d'ADN en bactéries et cellules eucaryotiques non-animal telles que des mycètes, des algues et des usines.

La transfection des cellules animales implique typiquement d'ouvrir les pores ou les « trous » passagers dans la membrane de plasma de cellules, pour permettre la prise du matériel. Le matériel génétique (tel que les éléments supercoiled d'ADN ou de siRNA de plasmide), ou même les protéines telles que des anticorps, peut transfected. En plus de l'électroporation, la transfection peut être effectuée en mélangeant un lipide cationique au matériel pour produire les liposomes, qui fondent avec la membrane de plasma de cellules et déposent leur cargaison à l'intérieur.

La signification initiale de la transfection était « infection par transformation », c.-à-d. introduction de l'ADN (ou de l'ARN) d'un virus ou d'un bactériophage d'eukaryote dans des cellules, ayant pour résultat une infection. Puisque la transformation de limite a eu un autre sens chez la biologie animale de cellules (un changement génétique permettant la propagation à long terme de culture, ou la saisie des propriétés typiques des cellules cancéreuses), la transfection de limite a saisi, pour les cellules animales, sa signification actuelle d'un changement des propriétés de cellules entraînées par l'introduction de l'ADN.

La transfection est une méthode par laquelle l'ADN expérimentale peut être mise dans une cellule mammifère cultivée. De telles expériences sont habituellement exécutées utilisant l'ADN copiée contenant les séquences programmées et les régions de commande (instigateurs, etc.) afin de tester si l'ADN sera exprimée. Puisque l'ADN copiée a pu avoir été intensivement modifiée (par exemple, des accepteurs de protéine sur l'instigateur ont pu avoir été modifiés ou retirés), la transfection est employée souvent pour tester si une modification particulière affecte la fonction d'un gène.

Diagramme de transfection :

Applications de transfection

La capacité de synthétiser l'ARN dans le laboratoire est critique à beaucoup de techniques. Des sondes radioactives et non-radioactives d'ARN sont exigées pour beaucoup de protocoles, et elles peuvent être synthétisées facilement dans des réactions in vitro de transcription à échelle réduite permettant leur utilisation dans des hybridations de tache et des analyses de protection de nucléase.

• Vecteur ou ADN
• Cellules
• Réactif de transfection

La transcription in vitro exige un descripteur linéaire épuré d'ADN contenant un instigateur, triphosphates de ribonucléotide, un système de mémoire tampon qui inclut DTT et magnésium

La transcription in vitro exige un descripteur linéaire épuré d'ADN contenant un instigateur, triphosphates de ribonucléotide, un système de mémoire tampon qui inclut DTT et magnésium

Méthodes de transfection

Il y a de diverses méthodes d'introduire l'ADN étrangère dans une cellule eucaryotique. Beaucoup de matériaux ont été utilisés comme porteurs pour la transfection, qui peut être divisée en trois sortes : polymères, liposomes et nanoparticles (cationiques).

Une (et moindres fiables) des méthodes les meilleur marché est transfection par le phosphate de calcium, initialement découvert par F.L. Graham et A.J. van der Eb en 1973 [citation requise] (voyez également [1]). la solution saline HEPES-mise en mémoire tampon (HeBS) contenant des ions de phosphate est combinée avec une solution de chlorure de calcium contenant l'ADN à transfected. Quand les deux sont combinés, un précipité fin franchement - calcium chargé et négativement - du phosphate chargé formera, liant l'ADN à transfected sur sa surface. La suspension du précipité est alors ajoutée aux cellules à transfected (habituellement une culture de cellules développée dans une couche unitaire). Par un processus pas entièrement compris, les cellules en prennent du précipité, et avec lui, l'ADN.

D'autres méthodes emploient les composés organiques à plusieurs branches, soi-disant dendrimers, pour lier l'ADN et pour l'entrer dans la cellule. Une méthode très efficace est l'inclusion de l'ADN à transfected en liposomes, c.-à-d. les petits, membrane-délimités corps qui sont par certains côtés semblables à la structure d'une cellule et peuvent réellement fondre avec la membrane de cellules, déchargeant l'ADN dans la cellule. Pour les cellules eucaryotiques, le lipide-cation basé transfection plus typique est utilisé, parce que les cellules sont plus sensibles.

Une autre méthode est l'utilisation des polymères cationiques tels que le Deae-dextrane ou le polyethylenimine. Négativement - l'ADN chargée lie au polycation et le complexe est pris par la cellule par l'intermédiaire de l'endocytosis.

Une approche directe à la transfection est le pistolet de gène, où l'ADN est couplée à un nanoparticle d'un solide inerte (généralement or) qui « est alors tiré » directement dans le noyau des cellules de cible. L'ADN peut également être introduite dans des cellules utilisant des virus comme porteur. Dans ces cas-ci, la technique s'appelle la transduction virale, et, les cellules sont dites transduced.

D'autres méthodes de transfection incluent le nucleofection, l'électroporation, le choc de la chaleur, le magnetofection et les réactifs de propriété industrielle de transfection tels que Lipofectamine, le Dojindo Hilymax, le Fugene, jetPEI, l'Effectene ou le DreamFect.

Gamme de produits contre des méthodes passagères de transfection

Pour la plupart des applications de transfection, il est suffisant si le gène transfected seulement est transitoirement exprimé. Puisque l'ADN introduite dans le processus de transfection n'est pas habituellement insérée dans le génome nucléaire, l'ADN étrangère est détruite au stade avancé quand les cellules subissent la mitose. Si on le désire que le gène transfected reste réellement dans le génome de la cellule et de ses cellules de fille, une transfection stable doit se produire.

Pour accomplir ceci, un autre gène est Co-transfected, qui donne à la cellule un certain avantage de sélection, tel que la résistance vers une certaine toxine. Certaines (très peu) des cellules transfected auront par hasard inséré le matériel génétique étranger dans leur génome. Si la toxine, vers laquelle le gène Co-transfected offre la résistance, est alors ajoutée à la culture de cellules, seulement ces quelques cellules avec les gènes étrangers insérés dans leur génome pourront proliférer, alors que d'autres cellules mourront. Après avoir appliqué cette pression de sélection pendant quelque temps, seulement les cellules avec une transfection stable demeurent et peuvent être cultivées plus loin.

Un agent commun pour la transfection stable est Geneticin, également connu sous le nom de G418, qui est une toxine qui peut être neutralisée par le produit du gène résistant de néomycine.

La transcription in vitro exige un descripteur linéaire épuré d'ADN contenant un instigateur, triphosphates de ribonucléotide, un système de mémoire tampon qui inclut DTT et magnésium

Extrémités pour la transfection

• Utilisez les inhibiteurs de RNase toujours !
• Argent d'économie avec de la polymérase bactériophage de l'ARN T7 : Les clones avec une étiquette du N-terminal His-6 sont disponibles. Si vous obtenez ce clone, vous pouvez épurer des grands nombres de la polymérase T7 avec de forte activité (référence : Il B, Rong M, Lyakhov D, Gartenstein H, Diaz G, Castagna R, POIDS de McAllister, Durbin RK. Protéine Expr Purif. 1997, 9, 142-151).
• Pour retirer le descripteur d'ADN, employez une DNase RNase-libre. Nous avons utilisé la DNase RQ1 (Promega) ajoutée pendant 15 minutes et cela fonctionne bien. 

Enregistrer le réactif de Trasfection

• L'ARN mieux est enregistré à un pH neutre avec de l'EDTA.
• La mémoire tampon de TE est recommandée (EDTA de Tris-HCL, de pH 7.5, de 1 millimètre de 10 millimètres), toutefois ceci devrait être préparé avec de la RNase librement purifiée (preferablly l'eau de millipore).

Problèmes de transfection de dépannage

Transfections échouées

• Vieux réactif de transfection
• Agent incorrectement enregistré de transfection
• ADN de qualité inférieure ou vecteur
• Quantité insuffisante d'ADN
• Réactif insuffisant de transfection
• Trop d'ADN
• Trop de réactif de transfection

Références sur la transfection

Références sur la transfection

1. Bacchetti S, Graham F (1977). « Transfert du gène pour la kinase de thymidine aux cellules humaines kinase-déficientes de thymidine par l'ADN virale purifiée de simplex d'herpès ». Proc Acad national Sci Etats-Unis 74 (4) : 1590-4. PMID 193108.