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Protocole d'isolement de protoplaste



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Protocole d'isolement de protoplaste

protoplaste

Préparation des protoplastes métaboliquement compétents

 

Saji Menon et Vibha Tyagi
Institut de Birla de recherche scientifique, cercle de statue, Jaipur (Ràjasthàn), Inde

 

Matériaux requis pour l'isolement de protoplaste

  • Éthanol de 70%
  • 0.1% Chlorure mercurique
  • mannitol de 0.5M

 

  • Solution d'enzymes :
  • Cellulase 0.25% Macerozyme R-10 de 1%
  • 27.2 mg/l KH2PO4
  • 101 mg/l KNO3
  • 1480 mg/l CaCl2.2H2O
  • 246 mg/l MgSO4.7H2O
  • mannitol de 0.5M (pH 5.6)

 

  • Support de lavage de protoplaste de cellules :
  • mannitol de 0.5M (pH 5.6)
  • 27.2 mg/l KH2PO4
  • 101 mg/l KNO3
  • 1480 mg/l CaCl2.2H2O
  • 246 mg/l MgSO4.7H2O
  • Milieu de culture modifié de protoplaste       

(Le Tableau est énuméré ci-dessous)

 

Protocole pour la préparation des protoplastes métaboliquement compétents

  • Prenez les feuilles fraîches de 4-5 vieilles usines aseptiquement croissantes de semaine.
  • La surface stérilisent en éthanol de 70% suivi du traitement avec 0.1% chlorure mercurique pour 1 minute.
  • Lavez les feuilles complètement avec de l'eau distillée stérile.
  • Épluchez l'épiderme inférieur du tissu de feuille et placez-le dans la solution de mannitol de 0.5M pour une heure dans un petriplate.
  • Retirez la solution de mannitol et remplacez-la par la solution stérilisée par filtration d'enzymes.
  • Incubez les plats dans l'obscurité pendant 16-20 heures à 25oC.
  • Séparez la couche de protoplaste par filtration utilisant la membrane de nylon de 0.45µM.
  • Centrifugez le filtrat à 1000g pendant 10 minutes à 4 Oc.
  • Retirez le surnageant et resuspendez le granule dans le support de lavage de protoplaste de cellules.
  • Centrifugez à 1000g pendant 10 minutes.
  • Répétez l'étape 9 deux fois.
  • Suspendez enfin le granule de protoplaste à une densité de 1*105 ml/l dans le milieu de culture modifié de protoplaste.
  • Plaquez les protoplastes en tant que très bien couche mince dans les petriplates.
  • Incubez les plats à 25 Oc dans l'obscurité.

 

Milieu de culture modifié de protoplaste

S.No.

Constituants

Quantité

A

Sels minéraux

 

1

Nitrate d'ammonium

82.5 gm/l

2

Nitrate de potassium

95.0 gm/l

3

Acide borique

1190 mg/l

4

Dihydrogénophosphate de potassium

34 mg/l

5

Iodure de potassium

166 mg/l

6

Molybdate de sodium

250 mg/l

7

Dihydrate de chlorure de cobalt

25.0 mg/l

8

Dihydrate de chlorure de calcium

88.0 gm/l

9

Heptahydrate de sulfate de magnésium

74.0 gm/l

10

Tétrahydrate de sulfate de manganèse

4460 mg/l

11

Heptahydrate de sulfate de zinc

1720 mg/l

12

Pentahydrate de sulfate de cuivre

25.0 mg/l

13

Diamino tétra sel disodique d'acide acétique d'éthylène

7.45 gm/l

14

Heptahydrate de sulfate ferreux

5.57 gm/l

B

Sucres

 

1

Glucose

30.0 gm/l

2

Ribose

0.5 gm/l

3

Mannose

0.5 gm/l

4

Sorbitol

0.5 gm/l

C

Acides organiques

 

1

Pyruvate de sodium

5.0 mg/l

2

Acide citrique

10.0 mg/l

3

Acide malique

10.0 mg/l

D

Vitamines

 

1

Chlorhydrate de thiamine

100 mg/l

2

Nicotinamide

500 mg/l

3

Chlorhydrate de pyridoxine

500 mg/l

4

Pantothénate de calcium

250 mg/l

5

Biotine

100 mg/l

6

Acide ascorbique

75.0 mg/l

7

Riboflavine

50.0 mg/l

8

Inositol

100 gm/l

E

Hormones

 

1

phénoxy acide 2,4-Dichloro acétique (2,4-D)

0.5 mg/l

2

Purine aminée benzylique (BAP)

1.0 mg/l