Commanditez/Annoncez & Joignez à nous & Contactez-nous & Au sujet de nous & Aidez-nous

Biologie Moléculaire Blog

Poteaux Récents de Forum

 

Anticorps de Polyclonal

Tout au sujet des anticorps de polyclonal.

Ressources Externes Relatives d'Anticorps de Polyclonal - Protocoles :

• Tache Occidentale
• Immunoblot
• Immunoprécipitation (IP)
• Création des anticorps en utilisant des peptides

En outre station d'anticorps de visite pour plus sur des anticorps de Polyclonal. C'est un nouveau site qui énumère des fournisseurs d'anticorps, se renseignent sur des anticorps, et des protocoles.

Protocoles d'anticorps de Polyclonal:

• Souris d'Immunisation
• Préparation de sérum à partir de sang
• Immunisation de Lapin
• Procédé de saignement de lapin
• Obtention du sérum
• Précipitation de sulfate d'ammonium d'IgG de sérum
• Immunisation
• Protocole d'ELISA pour le criblage d'anticorps de Polyclonal

Anticorps de Polyclonal

 

Les anticorps de Polyclonal sont des anticorps dérivés de beaucoup de B-cellules ou lignes de B-cellule, semblables au mélange des anticorps trouvés en sérums de sang.

Les anticorps de Polyclonal sont donc un mélange de beaucoup de différentes spécificités d'anticorps.

Les préparations d'anticorps de Polyclonal achetées sont des mélanges des anticorps de beaucoup de différentes spécificités au même antigène.

L'immunisation d'un lapin, de la souris, de la chèvre, du poulet, ou de tout autre animal produit des anticorps de polyclonal. Des sérums animaux peuvent être utilisés directement, toutefois il vaut mieux de purifier des anticorps de polyclonal pour l'utilisation de laboratoire.

Préparation d'Anticorps de Polyclonal

Basé sur le protocole par Dr. David Bowtell

Immunisation des souris :

Des injections pour immuniser des souris pour la génération des anticorps de polyclonal devraient être rendues à des intervalles au moins de deux semaines distantes.

Les 2 adjuvants suivants ont été réussis :

• Adjuvant de Freund et adjuvant de MPL+TDM (RIBI ImmunoChem Research, Inc.). Le MPL est moins dangereux que le premier adjuvant.

1. Pour la première injection d'immunisation : injectez 15 - 50 ug si antigène en adjuvant de l'UL 200, injecté par voie sous-cutanée.
2. La deuxième injection devrait se produire 2 semaines plus tard ; Vous devez alors amplifier avec 15 - 50 ug d'antigène en adjuvant. (si le temps laisse, amplifiez encore un mois plus tard).
3. Saignent sept à 10 jours plus tard le sérum de souris et d'essai en utilisant l'analyse qui sera utilisée pour le criblage. Si le titre n'est pas assez haut, poussée encore deux semaines après poussée précédente.

DESSUS

Préparation de Sérum :

1. Après le rassemblement, on devrait permettre à le sang de coaguler pendant 60 minutes. à 37°C ou à O.N à 4°C.
2. Séparez le caillot des côtés du tube (sonner) à l'aide d'une pipette de pasteur. Placez le caillot à 4°C O.N.
3. Tournez à 10000 x g pendant 10 mn à 4°C pour séparer le sérum.
4. Le sérum peut être enregistré à -20°C après avoir ajouté le glycérol à 50%.

Si monoclonal des anticorps sont désirés, une fois que vous faites procéder un "bon" polyclonal et une méthode de criblage fiable à la prochaine étape.

DESSUS

Lapins :

Des lapins sont immunisés essentiellement comme décrit ci-dessus. Injections :

1. D'abord dans l'injection 100-200ug/1ml complète de Freund, deux sites (au-dessus de chaque épaule).
2. En second lieu 1 mois plus tard dans Freund INACHEVÉ comme ci-dessus.
3. Purge 2 semaines plus tard. Poussée 2 semaines plus tard encore (cycle de 2 + 2 semaines).

DESSUS

 

PRODUCTION DES ANTICORPS DE POLYCLONAL CHEZ LES LAPINS (BLANC DE NEUSEELAND)

Basé sur le protocole par Dr.Walter Steffen.

Les lapins devraient être de 3-4 kilogrammes en poids et environ 3 mois de . Au sujet d'un tiers du lapin ayez les anticorps et l'immunoactivity endogènes d'anti-kératine pour de divers autres composants cellulaires. Ceci souligne l'importance de prendre le sérum pré-immunisé de n'importe quel lapin donné.

Mémoires tampons et solutions :

• Solution saturée de sulfate d'ammonium, EDTA de 2 millimètres, pH 8.0
• 50 millimètres d'acétate d'ammonium, pH 8.0
• éthanol de 70%
• L'adjuvant de Freund (complet et inachevé)
• Salin protégé par phosphate (PBS) (voir ci-dessous)
• VASELINE
• Xylène

DESSUS

• Apportez le lapin de son camp et placez-le solidement dans un cadre retenant laissant l'oreille accessible. Gardez le calme de lapin relativement. Des volumes de sang jusqu'à 50 ml peuvent facilement être rassemblés de l'artère principale fonctionnant en bas du centre de la surface dorsale de l'oreille.
• Rasez l'oreille gauche autour de la veine gauche avec une lame de rasoir fraîche.
• Tamponnez l'oreille avec de l'éthanol ou l'isopropanol de 70%.
• Tamponnez l'oreille avec du xylène autour de la boucle d'artère-veine pour dilater.
• Tenez l'extrémité de l'oreille (fermement) et du tube de collection dans une main et avec l'insertion libre de main une aiguille 19G hypodermique dans l'artère dilatée. Le sang devrait commencer à couler immédiatement dans le tube de collection. Pour les meilleurs résultats utilisez une partie d'artère intermédiaire le long de l'oreille.
• Rassemblez jusqu'à 50 ml de sang. Appliquez-vous la pression juste antérieure au point d'entrée d'aiguille au saignement d'arrêt.
• Appliquez la VASELINE à l'oreille pour apaiser l'irritation de xylène.
• Mettez la VASELINE supplémentaire sur la coupe.

Obtention du Sérum :

DESSUS

• Tube de remous avec le sang rassemblé pour enduire la surface et pour empêcher la connexion de caillot au tube.
• Incubez à l'oC 37 pour 1 heure.
• Centrifugez à 2.500 g (plaçant #7 dans un dessus de table clinique) pendant 10 minutes.
• Retirez le caillot et tournez le sérum à 3.000 g pendant 10 minutes.
• Le sérum devrait être enregistré congelé.

Précipitation de sulfate d'ammonium d'IgG de sérum (oC 4, effectué dans la chambre froide) :

La précipitation de sulfate d'ammonium est une méthode facile pour obtenir une fraction assez pure d'IgG.

DESSUS

• Sérum de regroupement d'un lapin
• Sérum de poids
W1 = _____ g
• Tubes de lavage avec la minute. PBS et pèsent encore.
W2 = _____ g
• Ajoutez 2/3 volume de sulfate d'ammonium saturé par W2, l'EDTA de 2 millimètres, pH 8.0
Note : ajoutez très lentement, goutte-à-goutte tout en remuant à l'oC 4 ou utilisez la pompe péristaltique.
• Remuez pendant 15 minutes.
• Transfert aux tubes à centrifuger de 40 ml ; becher de lavage avec 3 parts de PBS : 2 parts de sulfate d'ammonium et ajoutent aux tubes.
• Rotation à 12.000 g (Beckman JA-20 : 10.000 t/mn) pendant 10 minutes.
• Jetez le surnageant.
• Resuspendez le granule dans PBS [ 1/2 W1 = 1/2 vol.. ].
• Tournez à 12.000 g pendant 10 minutes, jetez le granule.
• Rassemblez le surnageant dans le becher, murs de lavage avec PBS.
Déterminez W3 = _____
• Ajoutez 2/3 vol.. Sulfate d'ammonium saturé par W3, tout en remuant. Continuez de remuer pendant 15 minutes.
• Transférez la suspension aux tubes à centrifuger de 40 ml, tube de lavage avec la solution de sulfate de PBS/ammonium.
• Tournez à 12.000 g pendant 10 minutes.
• Jetez le surnageant.
• Resuspendez les granules dans 1/4 W1 PBS.
• Dialysez contre PBS, 3-times 6 heures pièce.
• Mettez le sérum dans un tube gradué, sac de dialyse de rinçage bien avec PBS.
• Apportez jusqu'à 1/2 W1 = 1/2 vol. dans PBS.
• Déterminez la concentration et la partie aliquote en protéine pour la mémoire. Mesurez l'absorption à 280 nm. L'absorption de 1 solution de mg/ml IgG est approximativement 1.5.

Immunisation :

DESSUS

• Dissolvez l'antigène de ~400-600 g (~200-300 g par injection) en 2.2 ml 50 millimètres d'acétate d'ammonium, mémoire tampon appropriée de pH 8.0 ou autre. La concentration dépend de l'antigénicité de la protéine à injecter.
• La quantité d'antigène requise pour immuniser un animal dépend d'elle antigénicité et la méthode d'immunisation. Si des protéines avec la basse antigénicité sont utilisées, il sera utile de dénaturer la protéine avec une basse concentration de SDS (jusqu'à 0.2%). Seulement l'antigène fortement purifié devrait être utilisé pour la production des anticorps de polyclonal. Une méthode facile pour obtenir un antigène pur est par SDS-PAGE. Des protéines peuvent être transférées à une feuille de nitrocellulose, être souillées avec Ponceau S, couper avec une lame de rasoir, et utiliser comme antigène (recherchez les protocoles standard dans SDS-PAGE).
• Élaborez l'adjuvant complet de 1.1.ml Freund avec une aiguille 20G hypodermique, puis élaborez 1.1 ml de solution d'antigène. Gelez le 1.1 ml restants pour la poussée.
• En maintenant le plongeur immobile, retirez l'aiguille et attachez un robinet 3-way stérile.
• Mélangez l'antigène à l'adjuvant en attachant une deuxième seringue en verre au robinet et en l'injectant dans les deux sens. (attention : quelques seringues en plastique pourraient réagir avec l'huile minérale.)
• Une émulsion complète sera formée après environ 20-30 minutes ; indiqué par une augmentation plutôt soudaine de la viscosité de la solution.

Attention : soyez sûr que le support est bloqué !
• Après attente de mélange environ 20 minutes avant injection à la commande que le mélange est complet (s'inachevée, l'huile séparera).
• Rasez en arrière du lapin des lames d'épaule au bassin.
• Nettoyez en arrière avec de l'éthanol ou l'isopropanol de 70%
• Injectez sous la peau dans environ 10-20 côtés le long de l'épine entre la lame d'épaule et le bassin en utilisant une aiguille 21G hypodermique. (note : Première injection une semaine après le dernier saignement de preimmune).
• Attendez un mois et l'amplifiez avec un mélange d'antigène et d'adjuvant inachevé. Évitez les cicatrices de l'injection précédente.
• Saignez après une semaine pour vérifier l'immunisé-réponse. La poussée devrait être répétée, si l'immuno-réaction était trop faible ; cependant, un lapin différent devrait être choisi, si le lapin ne réagissait pas du tout /LI >

Références : Garvey, J.S., Cremer, Nord-est, Et Sussdorf, CAD (1977) Dans : Méthodes en immunologie. Publication. Benjamin/Cummings Publishing Company. La Masse de Lectures. pp 545

DESSUS

Criblage d'anticorps de Polyclonal en utilisant l'analyse d'ELISA

Protocole d'ELISA pour l'écran d'anticorps :

Matériaux pour ELISA :

plats de ° - 96 puits Dynatech Immulon, type 2. (Fisher 17-0221-199).

° PBS, TBS

° PBS + 0.1% Tween 20 ou TBS + 0.1% Tween 20.

° bloquant la solution = 2% BSA (type V) dans PBS. (ajoutez 0.02% azoture pour un entreposage plus prolongé.)

mémoire tampon d'Elisa de ° = 2% BSA + 0.1% Tween 20 dans PBS (azoture facultatif).

anticorps de ° = peroxydase 1 de raifort joints par enzyme

substrat de ° = ABTS - 100X (de Zymed 00-2001)1

mémoire tampon du ° HRP : acide citrique de magnésium du citrate pH 4.2(490 de Na de 100mM + citrate de Na du magnésium 720

dihydrate + 50 ml H2O, pH 4.2).

peroxyde d'hydrogène de ° 30% (1000X)

DESSUS

Protocole d'ELISA pour l'anticorps de Polyclonal

1) ADSORBTION D'ANTIGÈNE

a) AG dilué à 10 ug/ml dans PBS.

b) Ajoutez l'UL 100 de la solution d'AG à chacun bien.

c) Laissez O.N couvert d'enveloppe de saran, à 4°C.

2) BLOCAGE

a) L'AG non lié de lavage en inversant les plats et en effleurant les puits sèchent.

b) Rinçage en ajoutant PBS à chacun puits et en l'inversant encore (l'utilisation injectent la bouteille).

c) Répétez le rinçage deux fois.

d) Ajoutez l'UL 100 de bloquer la solution au chaque bien, laissez 1 heure à la température ambiante ou à l'O.N à 4°C.

3) ANTICORPS PRIMAIRE

a) Ajoutez l'anticorps à tester :

Sup des cellules = l'UL 25, se mélangent bien par pipeting en haut et en bas (10 fois).

sérum, ascite = 1:100 et un serie de 1/5 de dilutions. Faites les dilutions en bloquant la solution.

b) Laissez 1 heure à la température ambiante ou à l'O.N à 4°C.

4) ANTICORPS SECONDAIRE

a) Anticorps non lié de lavage 4 fois avec PBS + 0.1% Tween 20.

b) Ajoutez l'UL 100 de l'anticorps joint par enzyme à tous les puits. Faites les dilutions appropriées dans la mémoire tampon d'Elisa. (ex : HRP est 2000X).

c) Laissez 1 heure à la température ambiante ou à l'O.N à 4°C.

5) SUBSTRAT

a) Substrat de Disolve dans l'eau.

b) Plat de lavage 4 fois avec PBS + 0.1% Tween 20 (utilisation TBS au lieu de PBS pour AP).

c) Ajoutez l'UL 100 du substrat à chaque puits.

d) Observez le développement de couleur. Ceci a pu prendre de quelques secondes à 20 minutes.

e) Si nécessaire, arrêtez la réaction en ajoutant l'UL 50 du NacOh de 4M.

f) Lisez l'absorption dans le lecteur d'Elisa à la longueur d'onde correcte (pour système de HRP 416 nm, pour AP - 405 nm).

DESSUS

d'Autres Sites Web d'Anticorps

Voyez que station d'anticorps est un nouveau site qui couvre des anticorps, des fournisseurs d'anticorps, et toute autre information anticorps-connexe.

Trouvez d'autres anticorps et sujets monoclonaux associés d'anticorps ici :