PCR Optimization?

[dnamolecule]

What is the best method for PCR Optimization?

thanks in advance

[admin]

PCR optimization is best done with one variable at a time, meaning you should vary your MgCL while all other conditions are kept the same. If you have access to a gradient pcr thermocycler, I would keep the reaction mix the same and just vary annealing temperatures.

Hope these tips help.
Admin.

[trinity84]

I've seen a nice site about PCR (ebook): www.pcrguru.com. There is a "table of contents" and according to this "table of contents" there is a whole arsenal of PCR optimization strategies.

[walid]

I'm sorry (it's in frensh)


Outils PCR

1/ Pour convertir des pmoles de primer en nanogrammes de primer:
(a x pmoles) (0,325 ng/pmole) x (b x bases)
a étant le nombre de pmoles de primer et b le nombre de bases du primer
Par exemple : pour calculer le nombre de ng correspondant Ã* 50pmoles d'un 22mer:
(50 x 0,325ng) x (22) = 357,5ng

2/ La concentration micromolaire (µM) d'un primer est équivalente Ã* des pmoles/µl
10 pmoles de primer dans une réaction PCR de 50µl correspondent Ã* une concentration de 10pmoles/50µl= 0,2µM

3/ Pour estimer les températures de fusion (Tm) des oligonucléotides:
Tm = 81,5 + 16,6 (log10[Na+]) + 0,41(%G+C) - (675/n)
n étant le nombre de bases de l'oligonucléotide
[Na+] étant la concentration saline molaire
Par exemple : Tm d'un oligonucléotide 22mer avec 60% de G+C dans une solution de KCI 0,05M
Tm = 81,5 + 16,6(-1,30) + 24,60 - 30,68 = 53,84°C

4/ Visualisation des produits PCR
Si vous ne détectez pas le produit d'une réaction PCR, la première variable Ã* contrôler est la sensibilité de votre méthode de détection. Des quantités d'ADN inférieures Ã* 10ng ne sont pas facilement détectées en coloration par le bromure d'éthidium. Il est possible de jouer sur la durée de l'exposition en photographiant le gel ou/et de décolorer le gel pour diminuer le bruit de fond fluorescent.

[molecule2005]

Thank you Walid, there are many French users that come to the website!

Merci!

[saurabh23]

i m not able to optimize my pcr? can u suggest how can i start for optimization of pcr?