western blot protocol

[walid]

WESTERN BLOT

Principe
Nous utilisons la technique de western blot afin de caractériser la présence de la protéine étudiée. Les protéines sont dénaturées Ã* 100°C en présence de sodium dodécyl sulfate (SDS). Ceci entraîne la suppression des structures secondaires, tertiaires et quaternaires des protéines permettant ainsi une fixation du SDS sur ces protéines et donc de les charger négativement (transformation en anions). La migration électrophorétique ne se fera donc plus qu’en fonction de la masse moléculaire de chaque protéine, étant donné que chacune possède maintenant la même charge. L’électrophorèse a pour but de séparer les protéines sur un gel de polyacrylamide, ensuite ce gel est mis en contact avec une membrane de nitrocellulose et, un courant allant du gel vers la membrane permet de fixer les protéines contenues dans le gel sur cette membrane. Le but ensuite est de pouvoir repérer les protéines étudiées sur le support. Pour cela, la membrane est incubée avec un anticorps primaire capable de reconnaître la protéine recherchée et de la fixer, puis un anticorps secondaire marqué Ã* la peroxydase est ajouté au milieu afin qu’il puisse se fixer sur le premier anticorps. La membrane est alors incubée avec du luminol qui est alors dégradée par la peroxydase libère de l’énergie lumineuse capable d’impressionner un film photographique hypersensible. Les protéines apparaissent alors sous la forme de bandes sombres sur le film.
Protocole
1/ Récupérer les protéines dans des tubes eppendorf avec 50 µl tampon laemli (2X)
2/ Vortexer et incuber 5 min Ã* 100°C
3/ On reprend les échantillons des protéines Ã* étudié qui sont déjÃ* incubé Ã* -80 °C.
4/ Tous les échantillons sont dilués au tiers par une solution échantillon et les milieux sont dénaturés pendant 10 minutes Ã* 100°C.
5/ L’électrophorèse, adaptée pour le système PROTEAN II (Biorad), est réalisée Ã* 20°C sur un gel de polyacrylamide Ã* 10 % Ã* 8% (PM {30-50Kda} en présence de sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE).
6/ Dans chaque puits il est déposé 40 µl de l'échantillon sachant qu’un puit contenant 10 µl de marqueur de poids moléculaires. La migration électrophorétique se fait Ã* 90 V pendant une durée d’environ 2 Ã* 3 heures, en fait c’est le front de migration formé par le bleu de bromophénol qui indique le moment où l’électrophorèse doit être arrêtée.

7/ Les protéines contenues dans le gel sont ensuite transférées sur une membrane de nitrocellulose. Pour cela le gel et la membrane sont mis en sandwiches entre deux feuilles de papier Whatman, puis l’ensemble est traversé par un courant électrique afin que les protéines se fixent sur la membrane. Cette étape se fait Ã* une intensité de 200 mA de 100 Ã* 150 V pendant 3 heures dans un tampon de transfert cette étape est réalisée Ã* 0°c pour évité les fortes température produit par le champ électrique. La qualité du transfert est vérifiée par la présence des taches colorées dans la colonne des marqueurs de poids moléculaire sur la membrane de nitrocellulose.

8/ Cette membrane est incubée pendant 1 heure avec le tampon TBST contenant du lait Ã* la concentration de 5 %, ceci permettra d’éviter des liaisons non spécifiques des anticorps utilisés par la suite.

9/ Incubation de la membrane pendant une nuit Ã* 4°C avec l’anticorps primaire qui est dirigé contre notre protéine d’intérêt dilué Ã* 1/1000 dans du lait Ã* 5% (dans du TBST).
10/ Le tampon TBST est ensuite employé pour laver la membrane 4 fois 10 minutes.
11/ l’anticorps secondaire marqué Ã* la peroxydase, et qui est dirigé contre les chaînes lourdes et légères des anticorps primaires. Il est dilué de 5000 Ã* 10 000 fois dans le même tampon que l’anticorps primaire, cette étape se fait pendant 1 heure Ã* température ambiante. L’excès d’anticorps est éliminé par quatre lavages de 10 minutes dans le tampon TBST.
12/ Les protéines sont maintenant marquées spécifiquement et peuvent être révélées par le kit ECL (Enhanced Chemiluminescence, Amersham). La peroxydase marquant l'anticorps secondaire oxyde le luminol en présence de peroxyde d’hydrogène. Le luminol excité revient Ã* son état initial en émettant une lumière Ã* 428 nm détectée par un film photographique (Hyperfilm ECL, Amersham).

13/ La membrane est mise au contact du luminol pendant une minute, puis avec le film photographique pour une durée de 1 Ã* 30 minutes.
14/ La révélation du film est arrêtée lorsque les taches sont suffisamment nettes et marquées. Ceci permet de visualiser la présence des zones sombres correspondant Ã* la protéine recherchée.
15/ La membrane est reprise afin d’être utilisée pour détecter une autre protéine. Elle est mise dans un tampon de stripping Ã* 50°C en pratiquant une légère agitation. Plusieurs lavages successifs sont réalisés, la suite du protocole est la même que précédemment, Ã* partir de l’étape de saturation de la membrane.

Liste des solutions et des tampons utilisés
Tampon de migration SDS-page
1 % SDS 50 ml de sol 20 %
Laemli (1X final) 950 ml de sol 10X

Tampon de transfert
Tris 15g
Glycine 72g
Méthanol absolu 1L
H2O désionisée qsp 5L

Laemli 2X
200 mM Tris pH 6.8 2 ml de sol 1 M
3% SDS 1,5 ml SDS 20%
5% β-mercaptoéthanol 1 ml de sol 100%
30% Glycérol 500 ug de sol 14,2 M
0,001 % Bromophenol 1mg

Tampon PBS
Nacl 80g
KCl 2g
Na2HPO4 2HO 7.2g
KH2PO4 2g
TBS Tween (10X)
150 mM NaCl 300 ml de sol 5M
1 M Tris pH 7.9 25 ml de sol 1M
10% Tween 20 1 ml
H2O qsp 1L (675 ml)

Tampon de Stripping
150 mM Tris Hcl pH 6, 8
2 % SDS
100 mM b-mercaptoethanol

[admin]

Bonjour Walid!

c'est tres bien merci beaucoup!!!

[endah_ayu]

Bonjour Walid....
le wester blot protocol is very clear..thanks for posting it....
Je veux savoir des choses that can make the work fail...
Sorry i use both french and english....i never use my french for 3 years and i already forget the word in french

Merci beaucoup Walid...

[hait77]

Merci walid !!
je voudrais savoir a propos des tampons de lyse tissulaire ?! pour ensuite utiliser le western blot.
merci.