Go Back   Science Forums Biology Forum Molecular Biology Forum Physics Chemistry Forum > Regional Molecular Biology Discussion > Forum Chemia
Register Search Today's Posts Mark Forums Read

Forum Chemia Forum Chemia


Rozdzielanie protein za pomoca HPLC

Rozdzielanie protein za pomoca HPLC - Forum Chemia

Rozdzielanie protein za pomoca HPLC - Forum Chemia


Reply
 
LinkBack Thread Tools Display Modes
  #1  
Old 01-09-2008, 04:32 PM
-=[zieluk]=-
Guest
 
Posts: n/a
Default Rozdzielanie protein za pomoca HPLC



Witajcie,

mam problem z rozdzieleniem mieszaniny trzech protein na kolumnie do
wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwroconym ukladzie faz
(Reverse-Phase HPLC). Oto krotka charakterystyka tego co mam w
laboratorium :-)

Kolumna: Zorbax LP100 C18 40 um (250 mm x 4,6 mm I.D.),
Chromatograf: Agilent 1100
oprogramowanie: ChemStation for LC 3D system Rev B.03.01 [317]

Faza ruchoma:
(A) acetonitryl/woda/Kwas trifluorooctowy (100:900:1 v/v/v),

(B) acetonitryl/woda/Kwas trifluorooctowy (900:100:0,7 v/v/v),

Probka: 2,2 mg/ml alfa-Lactalbumin,
2,0 mg/ml beta-Lactoglobulin A
2,0 mg/ml beta-Lactoglobulin B
(w wodzie o czystosci HPLC)

obj. wstrzykiwanej probki: 50 ul

Detekcja przy 220 nm i 280 nm

Detektor: DAD (tj. z matryca diodowa)

Czyste proteiny sa 90% czystosci (do PAGE), kupione w firmnie SIGMA.

Zeby nie walczyc z wiatrakami, staralem sie powtorzyc eksperyment z
artykulu S. Visser, et al. Phenotyping of bovine milk proteins by
RP-HPLC, J.Chromatogr., 584, 361-370 (1991); pelny tekst:
[Only registered users see links. ] Jednak w autor rozdzielal za
jednym zamachem wszystkie bialka z mleka a ten problem (na razie?)
mnie nie interesuje. Stad taki wyrafinowany gradnient faz ruchomych.
Zastosowalem taki sam gradient u siebie w labie i niestety nic mi nie
wyszlo: [Only registered users see links. ]

Jedyna roznica miedzy pomiarami Vissera a moimi, to ta, ze on mial
103 bar w ukladzie a ja mam tylko 15 bar. I na moim sprzecie nie dam
rady uzyskac wiecej

I to jest pierwsze z moich podejsc do problemu rozdzielenia tych
trzech protein.

Drugi sposob znalazlem w ksiazce Witkiewicza "Podstawy
chromatografii". Opisany jest przyklad rozdzielania 6-ciu zwiazkow
aromatycznych.
Autor zaczyna chromatografowanie od silnego stezenia skladnika
niepolarnego acetonitryl:woda 90:10. I nic sie nie dzieje, tzn.
skladniki wychodza nierozdzielone, dajac jeden pik. Zwiekszajac
stezenie wody w fazie ruchomej otrzymuje sie ladnie rozdzielone piki
chromatografowanych substancji. Probowalem i ja tak zrobic. Nic z
tego. Wychodza mi wprawdzie jakies piki ale wyglada na to, ze sposob
ze zwiekszaniem stezenia wody nic nie daje. Jak chromatografuje
osobno, czyste proteiny to dostaje jeden silny (wysoki), symetryczny
pik i dwa bardzo splaszczone.
Na tym wykresie przedstawilem chromatogramy dla trzech roznych
pomiarow:
[Only registered users see links. ]
A jak chromatogfaruje mieszanine tych czystych protein to dostaje cos
takiego: [Only registered users see links. ]

Co zatem radzicie azeby rozdzielic te 3 proteiny?
Reply With Quote
  #2  
Old 01-09-2008, 05:54 PM
AW
Guest
 
Posts: n/a
Default Rozdzielanie protein za pomoca HPLC

-=[zieluk]=- pisze:


Jeśli tak to znaczy, że masz uszkodzoną pompę, albo zapowietrzony układ.
Bo "ten sprzęt" wyciąga do 400 bar'ów bez problemu.


Radzimy dać sobie siana z tym gradientem - bo z tego co piszesz (bez
obrazy) nie za bardzo masz pojęcie po co on w ogóle jest (a w twoim
przypadku jest on do niczego).
Spróbuj izokratycznie (oczywiście po tym jak naprawisz sprzęt), stosując
26% fazy B.
Nastrzyknij tę mieszaninę (ważne: powinna być rozpuszczona w mieszaninie
(25% ACN + 75% H2O) + 0,1% TFAA) i pokaż co ci wyszło.

--
Pozdrawiam
AW
Reply With Quote
  #3  
Old 01-09-2008, 08:30 PM
AW
Guest
 
Posts: n/a
Default Rozdzielanie protein za pomoca HPLC

-=[zieluk]=- pisze:


I jeszcze jedno, zamiast 50 nastrzykuj 5 ul

--
Pozdrawiam
AW
Reply With Quote
  #4  
Old 01-10-2008, 12:09 AM
Tomasz Kozlecki
Guest
 
Posts: n/a
Default Rozdzielanie protein za pomoca HPLC

Co do ciśnienia, to zwróć uwagę, że była używane wypełnienie o uziarnieniu aż
40 mikrometrów, co zahacza już o zakres wielkości dla flasha, a nie HPLC. Przy
takim grubym żużlu ciśnienie zwrotne w układzie rzeczywiście może nie
przekraczać 15 bar. Niestety, w pracy Vissera nie podano średnicy cząstek
wypełnienia ale wygląda na to że kolumny HiPore RP-318 mają 5 do 10 mikronów.

Zastanawiają mnie też czasy retencji, ale nie mam doświadczenia z tak grubym
wypełnieniem... Jeśli mamy kolumnę 250 x 4.6 mm z wypełnieniem rzędu 3-5
mikronów, to objętość martwa wynosi na ogół około 3 ml (widać to ładnie w
pracy Vissera), a tu _wszystko_ eluuje w 3 minuty przy przepływie 1 ml/min!

--
Wysłano z serwisu Usenet w portalu Gazeta.pl -> [Only registered users see links. ]
Reply With Quote
  #5  
Old 01-10-2008, 07:25 AM
AW
Guest
 
Posts: n/a
Default Rozdzielanie protein za pomoca HPLC

Tomasz Kozlecki pisze:

Też się zastanawiałem czy to aby nie jest literówka i powinno być 4.0
ale teraz zerknąłem do katalogu i rzeczywiście ta kolumna ma tak grube
ziarno.
Tak więc dodatkowa uwaga dla autora wątku. Zmień kolumnę ta jest zła.
Znajdź kolumnę o ziarnie co najwyżej 5um i szerokich porach 200-300 um
(100 też ujdzie).


--
Pozdrawiam
AW
Reply With Quote
  #6  
Old 01-10-2008, 08:19 AM
Tomasz Kozlecki
Guest
 
Posts: n/a
Default Rozdzielanie protein za pomoca HPLC

Jeszcze uwagi na temat samego materiału kolumny. Z opisu wynika, że używasz
Zorbax LP100 C18. Pomijając już nieszczęsną grubość uziarnienia, to ma ona
pory 100 Angstromów, natomiast że używana przez Vissera HiPore 318 miała 300
Angstromów. Czy zastanowiłeś się nad tym? Wygląda na to, że wziąłeś pierwszą z
brzegu (albo i jedyną posiadaną)kolumnę, na której było napisane "do rozdziału
peptydów i białek", nie zastanawiając się co oznaczają symbole umieszczone na
niej, i wetknąłeś do chromatografu... Tak się nie robi, dwie kolumny C18, 300A
pochodzące od dwóch różnych producentów mogą mieć (i najczęściej maja)
zupełnie różne charakterystyki i przeniesienie wyników może być niezwykle
trudne. A co dopiero jak próbowałeś zastąpić kolumnę 300A 10-15 mikronów
złomem 100A 40 mikronów. Jakby ten rozdział się udał, to mógłbyś uznać że
dokonałeś cudu.

--
Wysłano z serwisu Usenet w portalu Gazeta.pl -> [Only registered users see links. ]
Reply With Quote
  #7  
Old 01-10-2008, 08:56 AM
Tomasz Kozlecki
Guest
 
Posts: n/a
Default Rozdzielanie protein za pomoca HPLC

Z tym 100A to bym nie przesadzał. Jak rozumiem, rozdział białek/peptydów
odbywa się na zasadzie oddziaływań hydrofobowych i mechanizmu wykluczenia.
Tak 100A bedzie wykluczała na poziomie kilku kDa i nie bedzie żadnego
rozdziału. To pewnie małe białka, ale 300A wydaje się konieczne.
Zauważyłeś(aś) że Sigma-Aldrich już nie handluje tym wypełnieniem? Ciekaw
jestem ile lat ma ta kolumna Zieluka i czy po prostu nie trafił już jej szlag
ze starości albo od zbyt długiego kontaktu z TFA.

--
Wysłano z serwisu Usenet w portalu Gazeta.pl -> [Only registered users see links. ]
Reply With Quote
  #8  
Old 01-14-2008, 10:10 AM
-=[zieluk]=-
Guest
 
Posts: n/a
Default Rozdzielanie protein za pomoca HPLC

On Thu, 10 Jan 2008 08:19:08 +0000 (UTC), "Tomasz Kozlecki"
<tk@NOSPAM.gazeta.pl> wrote:

Bardzo dziekuje za wszystkie opowiedzi i uwagi w nich zawarte.


Faktycznie moja wina. Nie wiem dlaczego probowalem rozdzielac te
bialka na tej wlasnie kolumnie. Przed rozpoczeciem pomiarow znalazlem
w literaturze, ze bialka podczas rozdzialu na RP-HPLC wymagaja
wypelnienia o srednicy porow 300 A. I zaraz po tym jak wszedlem do
laboratorium o tym zapomnialem


Tak zle nie bylo. Sprawdzilem oznaczenia ale nie porownalem z
dokladnie z oznaczeniami kolumny w pracy Vissera Teraz sobie pluje
w brode, ze nie napisalem na pl.sci.chemia miesiac temu.


Cenna uwaga.

Znalazlem tez wymiary tych bialek. I znow dalem ciala, bo one wyraznie
pokazuja, ze moja kolumna jest do niczego

Struktura alfa-Lactalbumin z mleka krowiego

[Only registered users see links. ]
rozmiary przyblizone
150x120x120 Angstremow

Struktura beta-Lactoglobulin A z mleka krowiego
[Only registered users see links. ]
rozmiary przyblizone
50x50x110 Angstremow

W labie znalazlem jeszcze trzy kolumny.

1) Supleco Discovery RP-Amide C16, 15x4.6 cm, ziarno 5 um, rozmiary
porow 180 A;
[Only registered users see links. ]


2) M&W Chromatographietechnik GmbH Chrom SA, wypelnienie: Zorbax Pro
10/60 C18, 250x4.6 mm, ziarno: 10 um. Nie moge znalezc ani w
Internecie ani w moim katalogu informacji na temat rozmiarow porow
tego wypelnienia. Choc sadze, ze jezeli w kodzie 10/60 pierwsza liczba
oznacza srednice czastek 10um (a to wiem na pewno, bo jest napisane na
kolumnie) to liczba 60 moze oznaczas rozmiar porow - 60 A.

3) M&W Chromatographietechnik GmbH, LiChrosorb NH2, 250x4.6 mm,
ziarno: 5 um, rozmiar porow: chyba 100 A
([Only registered users see links. ])

Jest jeszcze kolumna 4), ktora chcialbym kupic:
[Only registered users see links. ]
Praktycznie jest to ta sama kolumna, ktora uzywal w badaniach Visser,
250x4.4 mm, ziarna 5 um, pory 300A.

Moje wnioski: Mozna by sprobowac dokonac rozdzialu na kolumnie 1),
kolumna 2) odpada, bo ma zbyt waskie pory, kolumna 3) odpada, bo ma
faze z grupa propyloaminowa a takich nikt nie stosowal przy rozdziale
bialek pochodzacych z mleka, a ponadto posiada zbyt waskie pory.

Czy jest sens probowac rozdzielac na kolumnie 1) czy nie tracic czasu
i od razu kupic kolumne 4)?
--

Pzdr
El zieluk - [Only registered users see links. ]
Reply With Quote
  #9  
Old 01-14-2008, 06:41 PM
Tomasz Kozlecki
Guest
 
Posts: n/a
Default Rozdzielanie protein za pomoca HPLC

O, teraz można rozmawiać


Samokrytyka przyjęta W końcu człowiek uczy się całe życie...


To fajna koluma polar-embedded, ale wątpie czy dobra do tego rozdziału. Świetnie
sprawdza się przy rozdziale farmaceutyków, ale nie białek. Zwróć uwagę na 2 zdania
na stronie, która jest w linku:
- Unique selectivity compared to C18
- Less hydrophobic than C18 columns
Konkluzja: w Twoim przypadku kolumna do doopy


Jak na mój mały rozumek, to masz racje. 60A = do niczego.


Kolumny aminowe stosuje się prawie wyłącznie do rozdziału mono- i disacharydów.
Wniosek: do doopy.


O, ta wygląda dobrze. Musisz tylko pamiętać o jednej rzeczy: dwa wypełnienia o
takim samym uziarnieniu, porowatości i fazie stacjonarnej, pochodzące od dwóch
różnych producentów NIGDY nie są identyczne, chyba że świadomie jest to podróba, na
przykład Spherisorb Watersa i Sphereclone Phenomenexa. Zawsze odmienny proces
produkcyjny powoduje że będą się one róznić retencją, bo inne stipień pokrycia, %C,
powierzchnia właściwa, zamknięcie lub nie, krzemionka typa A, B lub C... i 100
innych czynników. Od lat z uporem maniaka walcze z ludźmi, którzy twierdzą że
można ot tak, po prostu wymienic kolumnę od jednego producenta na inną. To się może
udać, ale wcale nie musi. W każdym razie na kolumnie 4) będziesz prawdopodobnie
musiał od nowa zoptymalizować rozdział, bo parametry od Vissera wcale nie muszą być
dla niej odpowiednie. I pamiętaj że ciśnienie zwrotne będzie znacznie wyższe, bo
jest tu ziarno 5 mikronów, a nie 10-15 jak w HiPore.

Powodzenia!

--
Wysłano z serwisu Usenet w portalu Gazeta.pl -> [Only registered users see links. ]
Reply With Quote
  #10  
Old 01-14-2008, 06:48 PM
Tomasz Kozlecki
Guest
 
Posts: n/a
Default Rozdzielanie protein za pomoca HPLC

Jeszcze dwie uwagi. Do rozdziału białek trzeba używać kolumny do tego przeznaczone.
Zwykła C18, nawet 300A mogą nie tolerować TFA. Kolumny białkowe sa przystosowane do
pracy z tym paskudztwem.
Druga uwaga: sądząc z Twoich pytań zostałeś rzucony do rozwiązania problemu na
którym, hmmm, nie za bardzo się znasz. Znajdź w okolicy kogoś znającego się na
HPLC, wez 0.7 litra, czy co tam ta osoba pije i spróbuj dowiedzieć się krok po
kroku jak się właściwie takie rzeczy robi. Najlepiej zrób to pod kontrolą takiej
osoby. Bez doświadczenia HPLC potrafi być pasmem udręk i niepowodzeń...
Doświadczenie wcale nie gwarantuje, że udręki i niepowodzenia znikną, ale znacznie
zwiększa szanse sukcesu.

--
Wysłano z serwisu Usenet w portalu Gazeta.pl -> [Only registered users see links. ]
Reply With Quote
Reply

Tags
hplc , pomoca , protein , rozdzielanie


Thread Tools
Display Modes

Posting Rules
You may not post new threads
You may not post replies
You may not post attachments
You may not edit your posts

BB code is On
Smilies are On
[IMG] code is On
HTML code is Off
Trackbacks are On
Pingbacks are On
Refbacks are On

Forum Jump

Similar Threads
Thread Thread Starter Forum Replies Last Post
Human Cytome Project - Update 24 Jan. 2005 Peter Van Osta Cell Biology and Cell Culture 1 08-01-2010 02:18 PM
Human Cytome Project - Update 6 Jan. 2005 Peter Van Osta Cell Biology and Cell Culture 0 01-06-2005 11:18 AM
New Saccharomyces Sequences 11/27/04 Mike Cherry Yeast Forum 0 11-29-2004 12:39 AM
New Saccharomyces Sequences 05/19/04 SGD Sequences Yeast Forum 0 05-23-2004 04:06 PM
New Saccharomyces Sequences 09/10/03 SGD Sequences Yeast Forum 0 09-11-2003 01:33 AM


All times are GMT. The time now is 04:39 PM.


Powered by vBulletin® Version 3.8.4
Copyright ©2000 - 2014, Jelsoft Enterprises Ltd.
Copyright 2005 - 2012 Molecular Station | All Rights Reserved
Page generated in 0.23522 seconds with 16 queries