Mehrfach-Ligation

Hej ihrs,

hat jemand von Euch Erfahrungen mit Mehrfach-Ligationen ?
Nach einem Doppel-Verdau erhalte ich 5 Fragmente. Ein Fragment davon
verändere ich (Basensubstitution) und will dann dieses und die
restlichen 4 wieder zusammenführen. Nun könnt ihr euch ja vorstellen,
dass das nicht so einfach wird. Da das ganze Plasmid über 13kb groß
ist, kann ich nicht einfach alle Klone sequenzieren. Andere
Schnittstellen sind leider auch so schwierig.

Hat jemand eine Idee ?

Vielen Dank schonmal.
Grüße
TeeGee

"TeeGee" <[Only registered users see links. ]> wrote:


Erfahrungen damit nicht, aber mit einer anderen Methode grosse
Plasmide zu verändern.


Was tauscht du aus, eine Base?


Hast du schonmal an Modifikation mittels homologer Rekombination
gedacht? Du brauchst dafür einen passenden Bakterienstamm und lange
Oligonukleotide. Screening für diese Methode läuft per PCR. Wenns das
in Frage kommt, suche ich die passenden Artikel bzw. das Protokoll
gerne heraus. Als Startpunkt ist auch
[Only registered users see links. ] interessant, daher stammt die
Methode. Bisher haben wir die neuere dort aufgeführte MEthode nicht
verwendet.

Christian

--
Immerhin ist die relative Fluechtigkeit des Mediums Computer dem Gehalt vieler Bilder
in idealer Weise angemessen, waehrend man bei Papierbildern immer ueberlegt, ob "es das
Bild wert" sei. Oliver Corff, 23.08.05 in drf

Hi Christian,

danke für Deine Antwort. :-)

ja, ich möchte eine Base verändern.

Ich dachte Homologe Rekombination wäre in meinem Fall ungeeignet, da
das Ausgangsplasmid ja über 13 kb groß ist und das für E.colis nicht
gut verträglich (oder?). Daher subklonier ich nur den betreffenden
Teil in einen kleinen Vektor, mach dort die Mutation (gerichtete
Mutagesese) und wollte das veränderte Teilchen wieder
zurückklonieren. Naja und da ich dafür entsprechend die gleichen
Restriktionsenzyme in dem Ausgangsplasmid wie auch im Vektor haben muß
wegen der Religation hab ich dann recht viele Fragmente zu ligieren.
hmmmmm ...
geht das einfacher ?

Grüße
TeeGee



Christian Praetorius schrieb:

Huhu,
Am 31 Oct 2005 03:12:35 -0800 schrieb TeeGee:

BTW, du willst
[Only registered users see links. ]

und insbesondere

[Only registered users see links. ]

lesen, mach aber besser einen Bogen um

[Only registered users see links. ]

machen, wenn du noch etwas vorhast...


Eventuell auch einmal die Sequenz ganz genau ansehen, hin und wieder
zeigen die entsprechenden Programme (kennst du BTW schon
[Only registered users see links. ] ?) nicht alle Schnittstellen an.

HTH,
Andr'ein Jahr kein Labor mehr von innen gesehen'eas

Hi Andreas,

ja, danke für den Tipp, aber die Restriktionsstellen stimmen leider
alle.

Grüße
TeeGee

Andreas Sielczak schrieb:

Hallo,
TeeGee schrieb:
Hast du mal versucht, das ursprüngliche Plasmid mittels Teilverdau und
Gelaufreingung so vorzubereiten, dass da nur dein auszutauschendes
Insert noch fehlt?
Sind vielleicht mehrere Versuche nötig, bis du da genug zusammen
kriegst, mit ordentlich verdünnten Enzymen sollte das aber möglich sein.
Viel Erfolg
Sabine

"TeeGee" <[Only registered users see links. ]> wrote:


Das habe ich auch gemacht.


Das hängt vom Stamm ab, den du verwendest. Wir hatten DH10B Stämme,
die über die entsprechenden induzierbaren Rekombinationsmechanismen
verfügten. Gemacht haben wir das ganze mit einem BAC von 220kb. Der
ist dann allerdings nur einmal pro Bakterium vorhanden. Aber wenn du
bereits ein 13kb grosses Plasmid hast, ist das ohnehin lowcopy.
Problem dabei ist eher, das vermutlich nicht alle Plasmide der Zelle
rekombinieren und du dann nicht trennen kannst, welche positiv sind
und welche nicht. Per PCR ist das nicht möglich.

Christian

--
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Hallo Sabine,

vielen lieben Dank für den Tipp. Das klingt echt vielversprechend und
mit ein bisschen Glück ist es vielleicht zu schaffen. Ich probier das
auf jeden Fall mal aus. Herzlichen Dank.
:-)))

TeeGee