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¿donde está mi plásmido?

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  #1  
Old 11-10-2010, 04:35 PM
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Hola a todos.
Llevo varios semanas con un problema que no consigo solucionar. Estoy trabajando con plásmidos de un tamaño relativamente alto. Son 16 kb. Ya solucioné el problema de crecimiento de las bacterias que eran transformadas con este plásmido reduciendo la cantidad de antibiotico. El problema actual es que cuando extraigo el DNA plasmidico mediante miniprep casera, observo el pellet de DNA perfectamente, al medir en el espectofotómetro, me da una buena concentración, pero cuando lo corro en el gel de agarosa no veo absolutamente nada, ni en los carriles ni en el pocillo. No es problema de la electroforesis porque el marcador de Promega de 1kb se ve perfectamente. He llevado minipreps en paralelo de plásmidos de 6 Kb y todo ha ido correctamente. Tambien lo he intentado con kit comercial y el resultado ha sido el mismo.
Me estoy planteando realizar un protocolo de extraccion de DNA para plásmidos de más de 40 Kb o bácmidos, pero sigo pensando que el problema no esta en la extracción. ¿Os ha sucedido alguna vez esto?, ¿me podeis dar alguna idea o solución?

Gracias de antemano por todo.
un saludo!
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  #2  
Old 11-10-2010, 08:49 PM
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Default Re: ¿donde está mi plásmido?

Al menos yo nunca he trabajado con plásmidos tan grandes, pero podría perfectamente haberse destrozado con el protocolo de extracción.

Así, podrías ver el pellet, podrías además medirlo por espectrofotometría (no necesitas que esté entero para que absorba la UV) pero no aparecería a la hora de chequear su integridad en el gel de agarosa.

Yo también creo que sería una buena idea probar con un kit para extraer plásmidos de mayor tamaño. Si no, podrías probar una extracción de ácidos nucleicos totales con óxido de silice.

Saludos!
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electroforesis , está , large plasmid , mini or maxiprep , plásmido , ¿donde


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