Go Back   Science Forums Biology Forum Molecular Biology Forum Physics Chemistry Forum > Regional Molecular Biology Discussion > Foro Biologia Molecular
Register Search Today's Posts Mark Forums Read

Foro Biologia Molecular Foro Biologia Molecular. Speak Spanish Molecular Biology Research Forum.


Alguien me puede ayudar con la tecnica de PCR en colonia!!!!

Alguien me puede ayudar con la tecnica de PCR en colonia!!!! - Foro Biologia Molecular

Alguien me puede ayudar con la tecnica de PCR en colonia!!!! - Foro Biologia Molecular. Speak Spanish Molecular Biology Research Forum.


Reply
 
LinkBack Thread Tools Display Modes
  #1  
Old 05-22-2008, 05:44 PM
Pipette Filler
Points: 498, Level: 9 Points: 498, Level: 9 Points: 498, Level: 9
Activity: 0% Activity: 0% Activity: 0%
 
Join Date: May 2008
Posts: 1
Thanks: 0
Thanked 0 Times in 0 Posts
Default Alguien me puede ayudar con la tecnica de PCR en colonia!!!!



Hola, tengo un problema con la técnica de PCR en colonia, ya que al realizarla para verificar el inserto de DNA en el vector TOPO pcr2.1 no logro obtener la amplificación del inserto, utilizo los primer universales M13 reverso y directo que vienen en el kit de TOPO, sin embargo las mismas clonas realizando una miniprep y su respectiva digestion con EcoRI resultan positivas.
Asi que si alguien me puede ayudar a resolver el problema de el porque no me sale la PCR en colonia se los voy a agradecer..
Reply With Quote
  #2  
Old 05-22-2008, 07:44 PM
danfive's Avatar
Nobel Laureate
Points: 8,612, Level: 64 Points: 8,612, Level: 64 Points: 8,612, Level: 64
Activity: 0% Activity: 0% Activity: 0%
 
Join Date: Jul 2007
Location: Houston TX
Posts: 969
Thanks: 12
Thanked 184 Times in 154 Posts
Default Re: Alguien me puede ayudar con la tecnica de PCR en colonia!!!!

Si el EcoRI digestion del miniprep trabaja, entonces si tienes ADN. Pero es posible que en la PCR tienes mucha or muy poca, puedes hacer diluciones de ADN.
O puede ser que tu PCR tiene problemas, concentraciones de primers o Mg++.
Trabaja tu control positivo the PCR?
Reply With Quote
  #3  
Old 02-09-2010, 06:35 PM
Pipette Filler
Points: 64, Level: 1 Points: 64, Level: 1 Points: 64, Level: 1
Activity: 0% Activity: 0% Activity: 0%
 
Join Date: Feb 2010
Posts: 2
Thanks: 0
Thanked 0 Times in 0 Posts
Default Re: Alguien me puede ayudar con la tecnica de PCR en colonia!!!!

Te paso un protocolo que a mí me funcionó de maravillas y es económico.
Tocás una colonia crecida entre 16-24 hs con un palill (escarbadientes) o de madera estéril y descargás las bacterias sobre 100 ul de una solución STET ( 0.1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8 y 5% Tritón X-100). Hervís las muestras 5 min (boiling de colonia) y luego las centrifugás a máxima velocidad por 10 min. De allí usás 2 uL por reacción de 20 uL. Funciona perfecto y como control para verificar que no hay inhibición agregá sobre el boiling de una colonia negativa (TOPO sin inserto) una pequeña cantidad de plásmido positivo o molde a partir del cual amplificaste el inserto y hacele la misma PCR. Esta técnica te permite evitar la gran inhibición que provoca la lisis bacteriana. Espero que tengas suerte.
Reply With Quote
  #4  
Old 02-13-2010, 03:15 PM
Pipette Filler
Points: 10, Level: 1 Points: 10, Level: 1 Points: 10, Level: 1
Activity: 0% Activity: 0% Activity: 0%
 
Join Date: Feb 2010
Posts: 7
Thanks: 0
Thanked 0 Times in 0 Posts
Default Re: Alguien me puede ayudar con la tecnica de PCR en colonia!!!!

Quote:
Originally Posted by [Only registered users see links. ] View Post
Hola, tengo un problema con la técnica de PCR en colonia, ya que al realizarla para verificar el inserto de DNA en el vector TOPO pcr2.1 no logro obtener la amplificación del inserto, utilizo los primer universales M13 reverso y directo que vienen en el kit de TOPO, sin embargo las mismas clonas realizando una miniprep y su respectiva digestion con EcoRI resultan positivas.
Asi que si alguien me puede ayudar a resolver el problema de el porque no me sale la PCR en colonia se los voy a agradecer..
Es un buen consejo el que te dan al decir que piques una colonia, la diluyas en agua, y la lleves a ebullicion por 5-10 minutos. de esa solucion, tomas 2 ul como template en la reaccion de PCR.

Por supuesto que al hacer la miniprep y digerir es mas factible que digiera (y seguramente si haces la PCR con los M13 a partir de la miniprep te salga perfecta) ya que hay menos contaminantes e inhibidores en el plasmido que ha pasado por las columnas o por los buffers de lisis propios de el protocolo de la minipreparacion.

Sin embargo, si tu haces tu PCR con los m13 a partir de la miniprep y obtienes la banda con el tamaño esperado, No deberias tener ningun problema si tu objetivo es secuenciar o subclonar tu fragmento.
Reply With Quote
  #5  
Old 02-13-2010, 03:15 PM
Pipette Filler
Points: 10, Level: 1 Points: 10, Level: 1 Points: 10, Level: 1
Activity: 0% Activity: 0% Activity: 0%
 
Join Date: Feb 2010
Posts: 7
Thanks: 0
Thanked 0 Times in 0 Posts
Default Re: Alguien me puede ayudar con la tecnica de PCR en colonia!!!!

Es un buen consejo el que te dan al decir que piques una colonia, la diluyas en agua, y la lleves a ebullicion por 5-10 minutos. de esa solucion, tomas 2 ul como template en la reaccion de PCR.

Por supuesto que al hacer la miniprep y digerir es mas factible que digiera (y seguramente si haces la PCR con los M13 a partir de la miniprep te salga perfecta) ya que hay menos contaminantes e inhibidores en el plasmido que ha pasado por las columnas o por los buffers de lisis propios de el protocolo de la minipreparacion.

Sin embargo, si tu haces tu PCR con los m13 a partir de la miniprep y obtienes la banda con el tamaño esperado, No deberias tener ningun problema si tu objetivo es secuenciar o subclonar tu fragmento.
Reply With Quote
Reply

Tags
alguien , ayudar , colonia , con , pcr , puede , tecnica


Thread Tools
Display Modes

Posting Rules
You may not post new threads
You may not post replies
You may not post attachments
You may not edit your posts

BB code is On
Smilies are On
[IMG] code is On
HTML code is Off
Trackbacks are On
Pingbacks are On
Refbacks are On

Forum Jump


All times are GMT. The time now is 11:38 PM.


Powered by vBulletin® Version 3.8.4
Copyright ©2000 - 2014, Jelsoft Enterprises Ltd.
Copyright 2005 - 2012 Molecular Station | All Rights Reserved
Page generated in 0.13796 seconds with 15 queries