ayuda para escoger anticuerpo secundario para ELISA

[oscardavidcom]

hola.

Debo hacer una sandwich ELISA buscando una proteina llamada GFAP y he encontrado en un articulo una revision sobre cual es el mejor anticuerpo primario y ya lo encontre. es uno de raton anti-GFAP pero estoy hecha un rollo sobre cual usar como secundario y como control positivo.

Para el control positivo creo que lo mejor seria una proteina GFAP purificada y ya encontre una de cerebro humano.

Para el segundo me sirve cualquiera de conejo anti-raton que este conjugado ... o el secundario debo coincidir con la espece de la proteina control o que debo hacer para definir el secundario adecuado y el metodo de revelado de color?

[danfive]

Originally Posted by oscardavidcom

hola.

Para el segundo me sirve cualquiera de conejo anti-raton que este conjugado ... o el secundario debo coincidir con la espece de la proteina control o que debo hacer para definir el secundario adecuado y el metodo de revelado de color?

Escoje uno de conejo anti-raton conjugado....yo lo compro de GE Healthcare anti-mouse-HRP conjugate.

[VP4Sec.]

si el anticuerpo primario es de raton, busca un anti raton producido en conejo que ya este conjugado, algunos vienen con peroxidasa, pero puedes utilizar uno con fosfatasa... es la que tu decidas en mi caso particular utilizo HRP-Goat antiMouse IgG (H+L)

[luisillo]

Originally Posted by VP4Sec.

si el anticuerpo primario es de raton, busca un anti raton producido en conejo que ya este conjugado, algunos vienen con peroxidasa, pero puedes utilizar uno con fosfatasa... es la que tu decidas en mi caso particular utilizo HRP-Goat antiMouse IgG (H+L)

Si, puedes usar ambos, pero los conjugados a HRP son más económicos y requieren menor tiempo de incubación para que den color.

A propósito del color, si utilizas un conjugado a HRP es recomendable que utilices TMB (tetrametil benzidina) como sustrato y algún ácido fuerte como solución de paro (stop solution), ya sea ac. clorhídrico o ac. fosfórico. Además, tendrás que estandarizar el tiempo de incubación con el TMB (debe ser en la oscuridad) y los volúmenes.