Welcome to Molecular Station! Tervetuloa Molecular Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Sinun täytyy rekisteröityä ennen kuin voit lähettää meidän foorumeilla tai käyttää lisätoimintoja. Register Now! Register Now! Its Free and Fast! Sen vapaata ja nopeaa!

Already registered? Oletko jo rekisteröitynyt? Login now below. Login nyt alla.

User Name: User Name:

Password: Salasana:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Jo rekisteröity ja Unohditko salasanasi? Click below to recover it. Klikkaa alhaalta sitä takaisin.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Liity nyt - se on nopeaa ja ilmaista!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station on suurin verkosto, tutkijat, tiedemiehet ja tieteen ystäville!

Recent Forum Posts Uusi Forum Posts

RNA Protocols RNA: n pöytäkirjat

RNA Encyclopedia RNA Encyclopedia

RNA Bioinformatics RNA Bioinformatiikka

RNA Forum RNA-Forum

RNA Blog RNA-blogi

RNA News RNA Uutiset

Northern Blot Pohjois-Blot

Copyright 2007 - Molecular Station Copyright 2007 - Molecular Station

AUDIO AUDIO Listen to a detailed Northern Blot Explanation ! Kuuntele yksityiskohtainen Pohjois-Blot Selitys!

History of Northern Blotting History of Northern blotting

Northern blotting is an RNA blotting technique which was developed in 1977 by Alwine et al. Northern blotting on RNA blotting-menetelmällä, joka on kehitetty vuonna 1977, jonka Alwine et al. at Stanford University (ref:1). Stanfordin yliopisto (viite 1). It was named after the Southern blot technique which blots for DNA, invented by Edwin M. Southern in 1975. Western blot , a method for blotting for proteins is also a play on the Southern blot naming and was named in 1981 (ref:2). Se on saanut nimensä sen jälkeen, kun Etelä-blot-menetelmällä, joka blots DNA: n, jonka keksi Edwin M. Etelä vuonna 1975. Western blot, menetelmä blotting-proteiineja on myös pelata Etelä-blot nimeäminen ja oli nimetty vuonna 1981 (viite: 2) .

Background Information - Northern Blot Technique Taustatietoa - Pohjois-Blot Technique

Northern analysis despite its age in the high tech world of Real Time PCR, nuclease protection assays (RPAs) and microarrays, is still the gold-standard for the detection and quantitation of mRNA levels. Pohjois-analyysi, vaikka sen ikä, high-tech maailma Real Time PCR, nuclease suojelun määritykset (RPAs) ja microarray, on edelleen kulta-standardi havaitsemista ja quantitation, mRNA tasoja. This is because northern blot analysis allows a direct comparison of the messenger RNA abundance between samples on a single membrane. Tämä johtuu siitä, että Pohjois-blot-analyysi mahdollistaa suoran vertailun perusteella messenger RNA runsautta välillä näytteiden yhdelle membrane.

In northern blot the main difference between the other blotting techniques is that RNA is the factor being detected. Pohjois-blot tärkein ero muihin blotting-tekniikoita on se, että RNA on tekijä havaitaan. Also, due to the fact that RNA is usually single-stranded, it creates complex secondary structures which affect its migration and hence denaturing conditions are used to run the gels (unlike Southern). Also, johtuu siitä, että RNA on yleensä single-stranded, se luo monimutkaisia toissijaisia rakenteita, jotka vaikuttavat sen muuttoliikkeen ja siten denaturointi käytetään pyörittämään geelit (toisin kuin Etelä).

RNA is separated out by RNA gel electrophoresis (usually agarose gel electrophoresis), subsequent transfer to membrane, hybridization with probe, and finally detection. RNA on erotettu pois, RNA geelielektroforeesilla (yleensä agaroosi geelielektroforeesilla), myöhemmin siirtää kalvo, hybridization kanssa koetin, ja lopulta selvittämistä.

Similarly to Southern blotting, the hybridization probes may be DNA or RNA in northern blotting. Vastaavasti Etelä-blotting, hybridization anturit voidaan DNA-tai RNA: n Pohjois-blotting.

A variant of the procedure known as the reverse northern blot was occasionally (although, infrequently) used. A variantti menettelyä kutsutaan käänteisessä Pohjois-blot oli joskus (vaikka harvoin) käytetään. In this procedure, the substrate nucleic acid (that is affixed to the membrane) is a collection of isolated DNA fragments, and the probe is RNA extracted from a tissue and radioactively labelled. Tässä menettelyssä, substraatti nukleiinihappo (jotka on kiinnitetty, membrane) on kokoelma eristetty DNA-fragmentit, ja koetin on RNA lähteestä uutettujen kudosten ja radioaktiivisesti merkitty.

The use of DNA microarrays that have come into widespread use in the late 1990s and early 2000s is more akin to the reverse procedure, in that they involve the use of isolated DNA fragments affixed to a substrate, and hybridization with a probe made from cellular RNA. Käyttö DNA microarray, jotka ovat tulleet osaksi laajaa käyttöä 1990-luvun lopulla ja alkuvuodesta 2000 on enemmän minun peruutukseen menettelyä, että ne sisältävät käyttö eristetty DNA-fragmentit kiinnitetty sellaiseen substraatti, ja hybridization kanssa koetin tehty cellular RNA . Thus the reverse procedure, though originally uncommon, enabled the one-at-a-time study of gene expression using northern analysis to evolve into gene expression profiling, in which many (possibly all) of the genes in an organism may have their expression monitored Näin käännetyn menettelyn, vaikka alun perin harvinaista, käytössä yksi-at-a-aika tutkimuksessa geenien ilmentyminen käyttäen Pohjois-analyysin kehittyä geenien ilmentyminen profilointi, joista monet (mahdollisesti kaikki), geenien organismi voi olla niiden ilmaisun seurattava

Applications of the Northern Blot Hakemukset, Pohjois-Blot

Northern blots have been superceded in most areas by Real Time PCR and microarray approaches. Pohjois-blots on superceded useimmilla aloilla Real Time PCR-ja microarray lähestymistapoja. It is not often used for clinical or diagnostic purposes. Se ei ole usein käytetty kliinisiä tai diagnostisiin tarkoituksiin.

The northern blot protocol and its variations are used however in molecular biology research to: Pohjoinen blot-protokollaa ja sen muunnelmia on käytetty kuitenkin molekyylibiologian tutkimukseen:

• a gold-standard for the direct study of gene expression at the level of mRNA (messenger RNA transcripts). kultaan standardi suora tutkimus geenien ilmentyminen tasolla mRNA (messenger RNA: n transkriptiota).
• detection of mRNA transcript size havaitsemista mRNA transkriptio kokoa
• study RNA degradation Tutkimuksessa RNA: n hajoamista
• study RNA splicing - can detect alternatively spliced transcripts Tutkimuksessa RNA pleissauksia - voi havaita vaihtoehtoisesti spliced transkriptiota
• study RNA half-life Tutkimuksessa RNA: n puoliintumisaika
• study IRES (internal ribosomal entry site) - to remove possibility of RNA digestion vs 2nd cistron translation. Tutkimuksessa IRES (internal ribosomien maahantulon site) - poistaa mahdollisuus RNA ruuansulatuksen vs 2 cistron käännös.
• often used to confirm and check transgenic / knockout mice (animals) käytetään usein vahvistaa ja tarkistaa, siirtogeenisten / knockout hiirillä (eläimet)

Disadvantages of Northern Blotting Haitat Pohjois blotting

The disadvantages of using northern blotting include: Haittoja käyttämällä Pohjois-blotting kuuluvat:

• Often radioactivity is used. Usein radioaktiivisuus on käytetty. This prevents ease of performing it, use and disposal. Tämä estää helposti suorittamaan se, käyttö ja hävittäminen. New methods of non-radioactive detection have been generated allowing non-radioactive detection. Uudet menetelmät ei-radioaktiivisten havaitseminen on syntynyt, joiden avulla ei-radioaktiivista selvittämistä. See Pierce. Katso Pierce.
• The whole process of northern blotting takes a long time usually, from sample preparation through to detection. Koko prosessi Pohjois-blotting kestää kauan yleensä, näytteen valmistelun kautta toteamiseen.
• If RNA samples are even slightly degraded by RNases, the quality of the data and quantitation of expression is quite negatively affected. Jos RNA-näytteet ovat jopa hieman huonontuneen, RNases, tietojen laatua ja quantitation sananvapaus on aivan vaikuttaa kielteisesti.
• The standard northern blot method is relatively less sensitive than nuclease protection assays and RT-PCR. Standardin Pohjois-blot-menetelmä on suhteellisen vähemmän herkkiä kuin nuclease suojelun määritykset ja RT-PCR. The sensitivity of northern blots may be increased with the use of nylon positively-charged membranes, use of a highly specific antisense probe. Herkkyys Pohjois blots voi olla lisääntynyt käyttö nailon myönteisesti peritään kalvot, käyttö on erittäin antisense-koettimia.
• Detection with multiple probes is a problem. Detection, jossa on useita luotaimiin on ongelma. Often, the membranes must be stripped before hybridization and detection with a second probe. Usein, kalvot on purettava ennen hybridization ja detektorina toisen koetin. This is a problem as harsh conditions are required to strip off probes from the blot and is also time consuming. Tämä on ongelma, koska ankarissa olosuhteissa vaaditaan poistat luotaimiin, Blot ja on myös aikaa vievää. Also, there is a limit to the amount of times a blot may be stripped. Lisäksi on rajoitettu määrä kertaa imupaperilla voidaan poistaa.

Advantages of Northern Blotting Edut Pohjois blotting

The advantages of northern blots include: Edut Pohjois blots kuuluvat:

• It is a widely accepted and well regarded method Se on laajalti hyväksytty ja katsoa menetelmä
• northern blotting is a straight-forward method Pohjois-blotting on suoraan eteen-menetelmä
• Often it is used as a confirmation or check Usein sitä käytetään kuin vahvistus tai tarkista
• Often a gold-standard Usein kulta-standardi
• it is a versatile protocol as it can allow the usage of many types of probes (vs Real time PCR) including: radiolabeled and non-radiolabeled, in vitro transcribed RNA and even oligonucleotides such as primers. se on monipuolinen protokolla, koska se voi mahdollistaa sen käytön monen tyyppisiä luotaimiin (VS Reaaliaikainen PCR), mukaan lukien: radioaktiivisesti ja ei-radioaktiivisesti, in vitro-tekstityksen RNA: n ja jopa oligonucleotides kuten pohjamaaleihin.
• Sequences with even partial homology, unlike real time PCR or other methods can be used as hybridization probes (ie sequence from different species for homology analysis, or even genomic fragments can be used). Sequences kanssa edes osittain homology, toisin kuin reaaliaikainen PCR-tai muita menetelmiä voidaan käyttää hybridization luotaimiin (eli järjestyksessä eri lajien homology analyysin tai jopa geenien fragmentit voidaan käyttää).

Northern Blot Protocol Pohjois-Blot pöytäkirjan

As mentioned the steps in northern blotting include: Kuten vaiheista Pohjois-blotting kuuluvat:

1. RNA isolation RNA: n eristäminen
2. Gel electrophoresis of RNA for separation Geelielektroforeesilla, RNA erotus
3. Transfer to membrane (usually positively charged nylon as RNA is negatively charged) Siirto membrane (yleensä positiivisesti varautuneet nailon kuten RNA on negatiivisesti varattu)
4. Cross-linking of RNA to membrane (usually by UV-crosslinking or chemical means) Cross-linkittäminen RNA-kalvo (yleensä UV-crosslinking tai kemiallisin keinoin)
5. Hybridization
6. Detection

Materials Needed for Northern Blot Protocol Tarvittavat materiaalit Pohjois-Blot pöytäkirjan

Buffer Recipes Buffer Reseptejä

20XSSPE (500 ml) 20XSSPE (500 ml)

• 3.6M NaCl : 105.2 g 3.6M NaCl: 105,2 g
• 0. 2M phosphate buffer pH 7.0: 100mL of 1M 2M fosfaattipuskuria pH 7,0: 100ml, 1M
• 20mM EDTA: 20mL of 0.5M 20mm EDTA: 20mL, 0.5M

Phosphate buffer pH7.0 (500ml) Fosfaattipuskuri pH7.0 (500ml)

• NaH2PO4 (monobasic) 140 mL of 1M NaH2PO4 (yksiemäksinen) 140 ml 1M
• Na2H2PO4 (Dibasic) 360 mL of 1M Na2H2PO4 (Dibasic) 360 ml 1M
• pH to 7.0 after both are added pH on 7,0, kun molemmat ovat lisätty

Hybridization buffer =HB (100mls) Hybridization puskuri = HB (100mls)

• 5X SSPE: 25mls 20X 5X SSPE: 25mls 20X
• 2% SDS: 20 mls 10% 2% SDS: 20 MLS 10%

* *Right before using add 1000ug denatured RNAse free CT DNA (heat to 95o for 3 min to denature) 5000ug yeast RNA * * Oikeus ennen käyttöä lisätä 1000ug denaturoitu RNAse vapaa CT DNA (lämmön 95o, 3 min denaturointivelvollisuutta) 5000ug hiivaa RNA

WASH: 2X SSPE + 0.1% SDS (500 mls) 50 mls 20X 5 mls 10% SDS= 0.1% SDS WASH: 2x SSPE + 0,1% SDS (500 MLS) 50 MLS 20X 5 MLS 10% SDS = 0,1% SDS

Running buffer for RNA gel (1L) Juoksu-puskuri-RNA-geeli (1L)

• 100 mls 10X MOPS 100 MLS 10X MOPS
• 52. 6 mls of formaldehyde 6 MLS formaldehydin
• 847. 4 mls H20 4 MLS H20

RNA Gel (70ml) RNA-Gel (70ml)

• 0.84 g agarose 0,84 g agaroosi
• 7 mls 10x MOPS 7 MLS 10x MOPS
• 58.38 mls H2O 58,38 MLS H2O
• Put gel in solution by heating. Laita geelin ratkaisu lämmittämällä. Let gel cool to 60°C, then add Formaldehyde to equal 0.66M --3.78 mls Anna geelin jäähdytetään 60 ° C, lisätään sitten Formaldehydi yhdenvertaiseen 0.66M - 3,78 MLS
• Pour gel in fume hood if possible Pour geelin savunerotuslaitteet huppu, jos mahdollista

RNA Samples for Northern Blot RNA-näytteet Pohjois-Blot

See RNA Isolation and Purification Katso RNA: n eristäminen ja puhdistaminen

RNA Gel RNA-Gel

After isolating RNA, the RNA must be separated out on a gel (usually agarose). Kun eristää RNA, RNA: ta on pidettävä erillään out-geeliä (yleensä agaroosi).

see RNA gels katso RNA-geelit

Northern Blot Transfer to Nylon Membrane Protocol Pohjois-Blot Siirto Nylon Membrane pöytäkirjan

After running the RNA gel , wash the gel with distilled water put on posiblotter. Käynnistämisen jälkeen RNA-geeli, pestä geelin kanssa tislattua vettä saattaa posiblotter.

Layers from top to bottom are: Layers ylhäältä alaspäin ovat:

• sponge
• 3-4 Whatman papers cut to size ( both of these up above should be soaked in 10X SSPE but not dripping) 3-4 Whatman papers leikattu kokoon (molemmat näistä jopa edellä olisi kasteltu 10X SSPE mutta ei valuu)
• gel mask. geeli peittää.
• Note: Make sure the gel overlays the mask so that it can seal membrane with line of the top of gel and the right top corner marked 3 pieces slightly bigger 3M paper hard plastic with holes Huomautus: Varmista, että geeli peittokuvat The Mask niin, että se voi sinetöidä membrane kanssa linjan ylä-geeliä ja oikealla ylhäällä kulmassa on merkitty 3 kappaletta hieman isompi 3M paperilla kovan muovin kanssa reikiä

Clamp on and make sure there is a good seal. Clamp ja varmista, että siellä on hyvä sinetti. Use 75-80 mm Hg of pressure for 1 hr or more. Käytä 75-80 mm Hg paineessa 1 h tai enemmän.

Blot membrane dry Blot membrane kuiva

Cross-linking Nylon Membranes - Northern Blot Protocol Cross-yhdistävän Nylon kalvot - Pohjois-Blot pöytäkirjan

• Cut top right corner wrap in saran wrap. Leikkaa oikeassa yläkulmassa wrap SARAN wrap.
• UV irradiate with RNA side down for 2.5 min. UV säteilyttää kanssa RNA puolella meneillään 2,5 min.
• Wash for a couple of minutes in hot 2X SSPE/0.1% SDS solution (Microwave solution for 30-45 seconds at 50% power. Pestään pari minuuttia kuumassa 2X SSPE/0.1% SDS-liuosta (Microwave ratkaisu 30-45 sekuntia 50% vallasta.
• Air dry Air kuiva

Pre Hybridization for Northern Blot Pre hybridization Pohjois-Blot

1. Pre Hybridize for 6 hours-overnight Pre Hybridize on 6 tuntia ja yön yli
2. Set oven to 65°C heat HB buffer to put SDS in solution Aseta uuni on 65 ° C lämmön HB puskuri esittää SDS-liuos
3. Roll up membrane inside piece of mesh and put into hybridizaton tube(2X SSPE/0.1%SDS) Käärimme membrane sisällä pala silmän ja ottaa hybridizaton putki (2x SSPE/0.1% SDS)
4. Check for air bubbles Tallenna tiedosto ilmakuplia
5. Put tube in oven balanced with another tube on opposite side Laita putki uuni tasapainoinen toiseen putkeen, ja vastakkaisella puolella

Labeling probe for Northern Blotting Labeling koetin Pohjois blotting

1. Put 25ng of probe in a total volume of 11uL with ddH2O Laita 25ng, koetin, jonka kokonaismäärä on 11uL kanssa ddH2O
2. Denature @ 95°C 3 min. Laimentavat @ 95 ° C 3 min. This is to get the probe single stranded and remove secondary structure which would prevent efficient hybridization. Tämä on saada koetin yhden stranded ja poistaa toissijaiset rakenne, joka estäisi tehokkaan hybridization.
3. Quick cool on wet ice. Quick jäähtyä, märkää jäätä. This is to keep the probe single stranded, free of secondary structure and not allow reannealing (or reforming of secondary structures). Tämä on pitää koetin yhden stranded, vapaa johdetun rakenne ja ei salli reannealing (tai uudistamalla johdetun rakenteet).
4. Add 4ul High Prime (Boehringer Mannheim) 5ul alpha radiolabeled P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul total Lisää 4ul High Prime (Boehringer Mannheim) 5ul alfa radioaktiivisesti P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul yhteensä
5. Incubate 10-15 min 37°C Inkuboidaan 10-15 min 37 ° C
6. Add 28uL of 1X TE, 2ul 0.5M EDTA, to 20ul reaction. Lisää 28uL, 1X TE, 2ul 0.5M EDTA, 20ul reaktion.
7. Pre-spin G-25 Sephadex column for 1 minute. Pre-spin G-25 Sephadex sarakkeessa 1 minuutin ajan.
8. Add 50ul sample to column and spin for 2.5 min in clinical centrifuge. Lisää 50ul näyte sarake ja spin, 2,5 min kliinisissä sentrifugoidaan. This is to purify probe away from label. Tämä on puhdistaa anturin päässä etiketissä.
9. Throw away column. Heitä pois sarakkeessa.
10. Mix in a new tube 100ug CT-DNA 50ug Yeast RNA in a 0.5mL tube. Mix uuteen putkeen 100ug CT-DNA 50ug Hiiva RNA on 0.5 ml putkeen.
11. Denature 95° 3 min Laimentavat 95 ° 3 min
12. Add to hybrid tube mix, hybridize at 65°C for 20-36 hrs Lisää hybridi-putki yhdistelmää, hybridize klo 65 ° C: ssa 20-36 tuntia

Post hybridization Protocol for Northern Blotting Post hybridization pöytäkirjan Pohjois-blotting

Hybridize for 36-48 hours then wash. Hybridize, 36-48 tuntia sen jälkeen pestä.

1. Heat up 2X SSPE/0.1% SDS (wash) heat up to 65° C (Use microwave or water bath to warm solution) Heat up 2X SSPE/0.1% SDS (pese) lämpöä jopa 65 ° C (Käytä mikroaaltouuni tai vesihauteessa lämmetä ratkaisu)
2. Take out tube and pour liquid into hot radioactive waste container. Take out putkeen ja kaataa nestettä kuumalla radioaktiivisen jätteen astiaan.
3. Rinse with 10ml wash do this twice and pour waste out. Huuhdellaan käyttämällä 10 ml pestä tehdä tämän kahdesti ja kaadetaan jätteet pois.
4. Put in 40 to 50 mls of wash and shake vigoursly. Put in 40-50 MLS pyykin ja ravistetaan vigoursly.
5. Put in hybridization oven for 20 min rotating. Put in hybridization lämpökaappiin 20 min pyöriä.
6. Pour down sink Pour alas uppoaa
7. Another 40-50mls and shake in oven. Toinen 40-50mls ja ravistetaan ja uuni.
8. Pour out to waste container (sink if not hot or toxic) and make sure it is no longer hot and then take out membrane. Pour ulos jätteen astiaan (pesuallas, jos ei ole kuuma tai myrkyllisiä) ja varmista, että se ei enää ole kuuma ja sitten tehdä kalvoihin.
9. Wash on shaker with 0.2XSSPE w/ 0.1% SDS at RT for 15 min. Pese, ravistelija kanssa 0.2XSSPE w / 0,1% SDS klo RT 15 min.
10. Air dry Air kuiva
11. Expose

Tips for Northern Blot Vinkkejä Pohjois-Blot

If you currently have a preferred method for isolating RNA, continue to use it. Jos sinulla on tällä hetkellä suosituin menetelmä eristää RNA edelleen käyttää sitä.

Always run an agarose gel of your RNA to assess the quality. Aina suorittaa agaroosigeeli oman RNA arvioida laatua. Do not only rely on spectrophotometry results. Älä vain luottaa siihen, spectrophotometry tuloksia.

* Use DEPC treated water and baked glassware. * Käytä DEPC käsiteltyä vettä ja paistetaan lasiesineet. This solution, absolutely, positively must be Rnase free. Tämä ratkaisu, ehdottoman myönteisesti on Rnase ilmaiseksi. Rnase is everywhere! Rnase on kaikkialla! Wear gloves, use only baked glassware, or virgin plastic. Käytä käsineitä, käytä vain paistetaan lasitavara, tai Virgin muovia. DePC treat your water, buffers (except Tris). DEPC hoitoon teidän vettä, puskurien (paitsi Tris). Be very careful. Ole hyvin varovainen.

Troubleshooting Northern Blots Vianetsintä Pohjois Blots

If you currently have a preferred method for isolating RNA, continue to use it. Jos sinulla on tällä hetkellä suosituin menetelmä eristää RNA edelleen käyttää sitä.

Discuss and post questions about this in the Northern Blot Forum . Keskustele ja post kysyttävää tämän pohjoisen Blot Forum.

Northern Blot References Pohjois-Blot Viitteet

1. Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977). Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977). "Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes". "Menetelmä Spesifisen RNAs in agaroosi geelit niiden siirrosta diazobenzyloxymethyl-paperi-ja hybridization DNA-koetin". Proc. Prosessorit. Natl. Acad. ACad. Sci. USA 74 (12): 5350-4. Yhdysvallat 74 (12): 5350-4.
2. W. Neal Burnette (April 1981). W. Neal Burnette (huhtikuu 1981). "'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate — polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A". "Western blotting": elektroforeesi siirto proteiinien osoitteesta natriumdodekyylisulfaattia - polyakryyliamideista geelit, muunneltua nitroselluloosa-ja röntgenfilmin detektorina vasta-aine ja radioiodinated proteiini A ". Anal Biochem 112 (2): 195-203. Anal Biochem 112 (2): 195-203.