Welcome to Molecular Station! Tervetuloa Molecular Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Sinun täytyy rekisteröityä ennen kuin voit lähettää meidän foorumeilla tai käyttää lisätoimintoja. Register Now! Register Now! Its Free and Fast! Sen vapaata ja nopeaa!

Already registered? Oletko jo rekisteröitynyt? Login now below. Login nyt alla.

User Name: User Name:

Password: Salasana:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Jo rekisteröity ja Unohditko salasanasi? Click below to recover it. Klikkaa alhaalta sitä takaisin.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Liity nyt - se on nopeaa ja ilmaista!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station on suurin verkosto, tutkijat, tiedemiehet ja tieteen ystäville!

Recent Forum Posts Uusi Forum Posts

Bookmark Bookmark Site Vedonvälittäjä vedonvälittäjä Site

Real-time PCR Real-time PCR

Real time and Quantitative PCR Reaaliaikainen ja määrällisiä PCR

Introduction to Real-Time PCR Introduction to Real-Time PCR

Real-time PCR is a type of quantitative PCR which measures the amount of cDNA or mRNA in a sample, either from a population of cells (tissue or cell culture), or recently even from a single cell. Real-time is used commonly to determine the expression of a gene's mRNA, and its expression levels (copy number of mRNA) during certain conditions (such as treating cells with a drug).  Real-time PCR can be used to compare normal (control) samples to disease samples, giving an idea as to expression changes which occur with pathogenesis.  Real-time PCR due to its sensitivity is also used in the detection of pathogens in the blood such as viruses. Real-time PCR on eräänlainen määrällisiä PCR joka mittaa määrä cDNA-tai mRNA-näyte, joko asukkaan solujen (kudoksen tai solun kulttuuri), tai äskettäin jopa yhdestä ainoasta solusta. Reaaliaikainen käytetään yleisesti, määrittää ilmaus geenin n mRNA, ja sen ilmaisun tasot (kopio määrä mRNA) aikana tietyin ehdoin (esimerkiksi käsittelemällä soluja, joilla on huume). Real-time PCR-menetelmää voidaan käyttää verrata tavanomaisiin (valvonta) näytteet taudin näytteet, jolloin idean, että sananvapaus muutoksia, jotka tapahtuvat kanssa patogeneesi. Real-time PCR vuoksi sen herkkyys on käytetty myös havaitsemiseksi taudinaiheuttajien veressä, kuten viruksia.

The development of real-time quantitative PCR has eliminated the variability traditionally associated with quantitative PCR, thus allowing the Kehittäminen tosiaikainen kvantitatiivinen PCR-menetelmällä on poistettava vaihtelevuutta perinteisesti yhdistetty määrällinen PCR, jolloin
routine and reliable quantitation of PCR products. rutiini-ja luotettavia quantitation ja PCR-tuotteita.

Table of Contents Table of Contents

Introduction to Real-time PCR Introduction to Real-time PCR

Real Time PCR: Advantages of Real-time PCR Real Time PCR: edut Real-time PCR

History of Real-Time PCR History of Real-Time PCR

Real-time PCR systems Available Real-time PCR-järjestelmien Available

Real-time PCR Protocols Real-time PCR pöytäkirjat

Mechanism of Real-time PCR Mechanism of Real-time PCR

Real Time PCR: Advantages of Real-time PCR Real Time PCR: edut Real-time PCR

Each cell type expressess a set of mRNA molecules, known as a transcriptome.  In response to stimuli, cells are able to up-regulate or down-regulate factors such as protein enzymes inside the cell by regulating the mRNA levels of these factors.  mRNA levels are not always correlated with protein levels so some caution is necessary, however generally mRNA levels do loosely correspond to protein levels.  Measuring the mRNA levels of certain factors inside a cell using real-time pcr is a method which will give clues as to the amounts of these factors or proteins. Kunkin solun tyyppi expressess joukko mRNA molekyylejä, jota kutsutaan transcriptome. Vastauksena ärsykkeiden, solut eivät pysty up-säännellä tai alas-sääntelemään tekijöitä, kuten proteiini-entsyymien sisällä solu säätelemällä mRNA tasot näistä tekijöistä. MRNA tasot eivät aina korreloi proteiinin tasoa niin joitakin varovaisuus on tarpeen, mutta yleensä mRNA tasot eivät löyhästi vastaa proteiinin tasoa. mittaaminen mRNA tasot tiettyjen tekijöiden sisällä solujen avulla reaaliaikainen PCR on menetelmä, joka antaa viitteitä siitä, että summat Näiden tekijöiden tai proteiineja.

Traditionally, mRNA levels inside the cell were measured using Northern blotting.  This technique is regarded as a gold-standard in the measurement of gene expression/mRNA levels as it uses radiolabeled probe to label the RNA, which is then quantified using a scintillation counter giving very accurate readings. Perinteisesti mRNA tasot sisällä solu oli mitattiin Pohjois-blotting. Tämä tekniikka pidetään kulta-standardi mittaamista geenien ilmentyminen / mRNA tasoja kuin se käyttää radioaktiivisesti koetin merkitä, että RNA, joka on sitten määrällisinä käyttäen scintillation counter antaa erittäin tarkkoja lukemia. Northern blotting although very accurate had several disadvantages including the use of radioactivity. Northern blotting vaikka hyvin tarkkoja oli useita haittoja, mukaan lukien radioaktiivisuuden. Northern blotting required the accurate measurement of mRNA and total RNA from cells extracted in order to compare samples. Northern blotting vaaditaan tarkkaa mittausta mRNA ja yhteensä RNA-solujen uutetaan, jotta voidaan vertailla näytteitä. This was a problem because although detection methods were very accurate, error could be introduced into Northern blotting (or RNA dot/slot blotting) through differences in total RNA/mRNA levels between samples (ie cell treatments, different tissues, different animals, etc.).  It also required relatively large amounts of RNA which required large numbers of cells. Tämä oli ongelma, koska vaikka havaitsemismenetelmät olivat hyvin tarkkoja, virhe voitaisiin tuoda Pohjois-blotting (tai RNA-piste / slot blotting) kautta erot yhteensä RNA / mRNA tasojen välillä näytteet (eli solujen hoitoja, eri kudoksiin, erilaisia eläimiä, jne. ). Sitä tarvitaan myös suhteellisen suuria määriä RNA, jossa vaaditaan suuri määrä soluja. Recently, mRNA gene quantification or real-time pcr methods have been improved and are easier to perform and do not require the use of radioactivity.  Researchers often only have access to small amounts of cells especially in the fields of stem cell research and primary cell research, and real-time pcr has made it possible to quantify mRNA levels from even very small numbers of cells and lately even single cells.  However, this extreme sensitivity of real-time pcr methods makes it vital to protect one's samples from contamination, which would lead to false results. Recently, mRNA geenin määrällisesti tai reaaliaikainen PCR-menetelmiä on parannettava ja on helpompi suorittaa ja jotka eivät edellytä käytössä radioaktiivisuutta. Tutkijat usein heidän ainoa mahdollisuutensa saada pieniä määriä soluja etenkin kantasolujen tutkimus-ja perusterveydenhuollon tutkimukseen Ja reaaliaikainen PCR on voitu mitata mRNA tasot jopa erittäin pieniä määriä soluja ja viime aikoina jopa yhden soluja. Kuitenkin, että äärimmäinen herkkyys reaaliaikainen PCR-menetelmien avulla on olennaisen tärkeää suojella omaa näytettä saastumiselta, joka johtaa vääriin tuloksiin. Current real-time pcr methods and systems also do not require the measurement of mRNA or cDNA sample concentrations before real-time pcr is conducted. Nykyinen reaaliaikainen PCR-menetelmien ja-järjestelmien lisäksi ei tarvita mittausta mRNA tai cDNA näytteen pitoisuudet ennen reaaliaikainen PCR on suoritettu.

History of Real-Time PCR History of Real-Time PCR

Higuchi et al.1,2 pioneered the analysis of PCR kinetics by constructing a system that detects PCR products as Higuchi et al.1, 2 uranuurtajana analysointi PCR kinetiikka rakentamalla järjestelmä, joka havaitsee PCR-tuotteita
they accumulate. ne kertyvät. This “real-time” system includes the intercalator ethidium bromide in each amplification reaction, Tämä "real-time"-järjestelmä sisältää intercalator ethidium bromidi kussakin vahvistinpiirejä reaktio,
an adapted thermal cycler to irradiate the samples with ultraviolet light, and detection of the resulting fluorescence mukautettu lämpösyklilaitteesta säteilyttää näytteet, joiden uv-valolle, ja havaitsemista tuloksena fluoresenssi
with a computer-controlled cooled CCD camera. kanssa tietokoneella ohjattavien jäähdyttää CCD-kamera. Amplification produces increasing amounts of double-stranded Amplification tuottaa yhä suurempia määriä double-stranded
DNA, which binds ethidium bromide, resulting in an increase in fluorescence. DNA: n, joka sitoo ethidium bromidi, mikä nostaa fluoresenssi. By plotting the increase in fluorescence By plotting kasvu fluoresenssi
versus cycle number, the system produces amplification plots that provide a more complete picture of the vs. kierron numero, järjestelmä tuottaa vahvistinpiirejä tontteja, jotka tarjoavat entistä kattavampi kuva,
PCR process than assaying product accumulation after a fixed number of cycles. PCR-prosessi kuin assaying tuote kertymisen jälkeen kiinteä lukumäärä jaksoissa.

External sites: see Real Time PCR at Real Time PCR Info! Ulkoiset sivustot: ks Real Time PCR-Real Time PCR-Info!

References for Real-Time PCR Viitteet: Real-Time PCR

1. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, PS, and Griffith, R. 1992. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, PS, ja Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Samanaikainen vahvistinpiirejä ja Spesifisen DNA-sekvenssejä.
Biotechnology 10:413–417. Biotekniikka 10:413-417.

2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., and Watson, R. 1993. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R. 1993. Kinetic PCR: Real time monitoring of DNA amplification reactions. Kineettinen PCR: Real time monitoring DNA amplification reaktioita.
Biotechnology 11:1026–1030. Biotekniikka 11:1026-1030.

Real-Time PCR Protocols Real-Time PCR pöytäkirjat	Real-Time PCR Bioinformatics and Databases Real-Time PCR Bioinformatiikka ja tietokannat	Learn about Real-Time PCR Opi Real-Time PCR	Real-Time PCR Kits and Products Real-Time PCR Kits ja Tuotteet	Real-Time PCR Forum Real-Time PCR Forum	Real-Time PCR Books Real-Time PCR Kirjat