Bioinformatics, Protocols, DNA RNA Protein Proteomics Bioinformatiikka, pöytäkirjat, DNA-RNA-Proteiini proteomiikka

Biology Home Protocols Bioinformatic Tools Biology Forums Molecular Biology Encyclopaedia Molecular Biology Images Bookmark Us! Biologia Etusivu pöytäkirjojen bioinformatiikan välineitä Biologia Forums Molecular Biology Encyclopaedia Molecular Biology Images Bookmark Us!

home > protein > protein-protocols > western-blotting > index.php etusivu> proteiinin> proteiini-protokollat> Länsi-blotting> index.php

Molecular Biology Home Science News Science Videos DNA RNA Protein Proteomics Research BETA! Bioinformatics Lab Equipment Molecular Biology Techniques Molecular Biology Products and Services Related Biology Links Molecular Biology Etusivu Tiede Uutiset Science Videos DNA-RNA-Proteiini proteomiikka Tutkimus BETA! Bioinformatics Lab-laitteet Molecular Biology Techniques Molecular Biology liittyviä tuotteita ja palveluja Biology Links

Molecular Biology Blog Molecular Biology Blog

Send this page to a friend Send this page to a friend

Intracellular Stations Solunsisäiset asemat

Antibody Botany Common Buffers Buffers Alphabetic Bookstore Cell Biology and Culture Gel Electrophoresis Histology Microarrays Immunology Mass Spectrometry Microbiology Molecular Imaging Peptide Proteomics Protein Microarray Chips PCR Real-Time PCR RNAi and SiRNA Stem Cell Biology Transfection Western Blot Vasta Botany yhteisen Puskurit Puskurit Alphabetic Bookstore solubiologian ja kulttuuri geelielektroforeesilla histologian microarray Immunology massaspekrometria mikrobiologian laitos Molecular Imaging peptidi proteomiikka Proteiini Microarray Chips PCR-Real-Time PCR RNAi ja SiRNA Stem Cell Biology Transfection Western Blot

Western Blot Western Blot

Western Blot Protocols Western Blot pöytäkirjat

Western Blot Forum Western Blot Forum

Western Blot Products Western Blot Tuotteet

Western Blot Books Western Blot Kirjat

Western Blot Troubleshooting Western Blot Vianetsintä

Western Blot Books Western Blot Kirjat

Western Blotting Protocol Western blotting pöytäkirjan

Western-blot protocol Länsi-blot-protokollan

Preparation of Samples for SDS-PAGE Gel Electrophoresis from Prepared Cell Lysates Näytteiden valmistaminen SDS-PAGE geelielektroforeesilla osoitteesta Valmistetut Cell Lysates

1. Prepare gels for SDS-PAGE Valmistetaan geelit, SDS-PAGE
2. Prepare 1X running buffer Valmistetaan 1X näkyä puskuri
3. Add 50 mL of beta-mercaptoethanol to 950 ml sample buffer (for 1 mL). Lisää 50 ml: n beta-merkaptoetanolia, 950 ml: n näyte puskurissa (1 ml). (only if you have not pre-added beta-mercaptoethanol to sample buffer) (vain jos et ole ennen lisännyt beeta-merkaptoetanolia näytteeseen buffer)
4. Add sample buffer to each sample (pre-determine how much sample you can load per well - BioRad thin combs can retain about 30uL. Large combs can accomate up to 50uL). Lisää näyte puskurissa kunkin näytteen (pre-määritellä, kuinka paljon näytteen voit ladata per hyvin - BioRad ohut kammat voi säilyttää noin 30uL. Large kammat voi accomate jopa 50uL).
5. Vortex samples briefly. Vortex näytteiden lyhyesti.
6. Poke a hole in cap of each tube (to prevent the tops popping when boiling) Poke on reikä Cap kunkin putken (estämiseksi Yläosat popping, kun kiehuvaa)
7. Boil in heating block/water bath at (95°C) for 5 minutes (lower temperatures have been shown to prevent non-specific protein aggregation) Keitetään lämmitys-lohko / vesihauteeseen (95 ° C) 5 minuutiksi (alemmat lämpötilat ovat osoittaneet, joilla estetään ei-proteiinin lisääminen)

After Boiling Protein Samples - Loading and Running the SDS-PAGE Gel Kun Boiling Proteiini Näytteet - Ladataan ja toimintaa SDS-PAGE-Gel

1. Centrifuge samples for 1 minute at high speed. Sentrifugoidaan näytteitä 1 minuutti kovaa vauhtia.
2. Load sample into each lane. Load näyte otetaan kunkin lane.
3. Load MW (molecular weight ladder) reference. Load MW (molekyylipaino ladder) viittaus. (you may want (voit
4. Run gel at 100V (100V through stacking gel, voltage can be increased up to 200V when running in separating gel with plenty of running buffer) Suorita geeliä 100V (100V kautta pinoaminen geeli, jännite voidaan korottaa enintään 200V kun käytetään erottaminen geeli runsaalla näkyä buffer)

Transfer of Protein Samples to Membrane Siirto Proteiini näytteiden Membrane

1. Prepare 1X Transfer buffer Valmistetaan 1X Transfer puskuri
2. Soak and shake gel in Transfer buffer for 15 min Soak ja ravistetaan geelin Transfer puskuri, 15 min
3. Soak nitrocellulose membrane (or PVDF) and filter paper (extra thick) for several minutes. Soak nitroselluloosa membrane (tai PVDF) ja suodatinpaperin (extra paksu) useita minuutteja.
4. Place sandwich on transfer cell: Paikka sandwich siirtoon solun:

Extra thick filter paper CLEAR Extra paksu suodatinpaperi CLEAR
Membrane
Gel Geeli
Extra thick filter paper BLACK Extra paksu suodatinpaperi BLACK

5. Electric transfer: 35V overnite or 90V for 1 hour depending on the size of your protein or your patience! Electric siirto: 35V overnite tai 90 V 1 tunti koosta riippuen sinun proteiini tai kärsivällisyyttä!

Western Blotting Protocol or Immunoblotting Western blotting pöytäkirjan tai immunoblottauksella

1. Prepare 1X TBST from stock solutions. Valmistetaan 1X TBST Osakepääoman ratkaisuja.
2. Prepare blocking buffer (3% Bovine Serum Albumin or 5% Blotting-grade milk (Blotto) in TBST). Valmistetaan estopuskuria (3% naudan seerumin albumiini tai 5% blotting-grade maito (Blotto) TBST). (you may want to try several different blocking times and conditions). (voit halutessasi kokeilla useita erilaisia esto-ajat ja ehdot).
3. Wash membrane in 1X TBST with shaking for 10 min. Pese kalvo, 1X TBST kanssa ravistamalla, 10 min.
4. Block at room temperature for 1 hour with blocking buffer (shaking or circular rotator) Block huoneenlämmössä 1 tunti kanssa estopuskuria (ravistamalla tai pyöreitä kääntäjää)
5. Incubate your membrane (PVDF or nitrocellulose) with primary 1° Ab antibody overnight (for difficult blotting conditions ie phosphorylation of proteins) or 1 hour for ( easy conditions such as total protein) at 4°C (overnite) or room temperature (1 hour incubation only) covered with saran wrap (gentle shaking). Inkuboidaan your membrane (PVDF tai nitroselluloosa) ensisijainen 1 ° Ab vasta-aine yössä (vaikea blotting edellytykset eli phosphorylation proteiinien) tai 1 tunti (Easy edellytykset, kuten proteiinin kokonaismäärän) 4 ° C (overnite) tai huoneenlämmössä (1 tunti itämisaika vain) peitetty SARAN wrap (Lempeä ravistamalla). You can use plastic tubs from the dollar store for this (use these only for blotting!) or use pipette box bottoms. Voit käyttää muovi porealtaat osoitteesta dollarin tallentaa tämän (käytä näitä vain blotting!) Tai käyttää pipetillä laatikon pohjat. The dilution for primary antibody is around 1:1000. Laimennusjärjestelmä perusasteen vasta-aine on noin 1:1000. See manufacturer's instructions. Katso valmistajan ohjeiden mukaisesti.
6. Wash with 1X TBST  3 X 15 min Pestään 1X TBST 3 X 15 min
7. Incubate your membrane (PVDF or nitrocellulose) with secondary antibody, 2° Ab for 30 – 45 min or (1 hour - for difficult blotting conditions) at room temperature. Inkuboidaan your membrane (PVDF tai nitroselluloosa) johdetun vasta-aine, 2 ° Ab, 30 - 45 min tai (1 tunti - vaikea blotting) ehdot huoneenlämmössä. The dilution for secondary antibodies is usually 1:10,000 or higher. Laimennusjärjestelmä sekundaarista vasta-aineita on yleensä 1:10000 tai suurempi. (ie 1uL of secondary in 10mL of TBST per membrane) See manufacturer's instructions.  You may want to add your antibody to blocking solution to decrease non-specific binding especially if you got high background in your first experiment. (eli 1uL johdetun, 10 ml, TBST per kalvo) Katso valmistajan ohjeiden mukaisesti. Haluat ehkä lisätä oman aineen esto ratkaisu pienentää ei-sitovia varsinkin jos sinulla korkea tausta ensimmäinen kokeilu.
8. Wash with TBST   4-5 X 10 min. Pestään TBST 4-5 X 10 min. This is the most important washing step. Tämä on tärkein pesu-askel.
9. ECL (5min) ECL (5min)
10. Expose to film. Altistaa elokuva. Usually exposure time of western blots is about 10-30 seconds. Yleensä altistuminen aika Länsi blots on noin 10-30 sekuntia. Longer (5-10 minutes) for phosphorylation. Pitemmät (5-10 minuuttia) phosphorylation. If you have a really weak signal, either you need to load more protein or try to increase exposure time (up to 30 minutes - you can try leaving it in a casette longer). Jos sinulla on todella heikko signaali, joko sinun täytyy ladata enemmän proteiinia tai yritä lisätä altistumisen aika (enintään 30 minuuttia - voit yrittää jättää se, kasetti enää).
11. Keep your membrane! Pidä membrane! You can keep your membrane in TBST 1X in the fridge for a while. Voit pidät membrane in TBST 1X, jääkaappi jonkin aikaa. You may need it for the following reasons: 1) checking loading (paper reviewers may ask for total protein or a loading standard such as actin). Saatat tarvita sitä seuraavista syistä: 1) tarkkailun lastaus (paperi reviewers voi pyytää proteiinin kokonaismäärän tai lastaus-standardi kuten aktiini). Also, you can probe initially for a phospho-protein and then strip and reprobe for total protein. Lisäksi voit koetin aluksi: phospho-proteiini ja sitten nauhat ja reprobe-proteiinin kokonaismäärän.

Also see our Western Blotting Membrane Stripping Protocol Katso myös Western blotting Membrane stripping pöytäkirjan