Welcome to Molecular Station! Tervetuloa Molecular Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Sinun täytyy rekisteröityä ennen kuin voit lähettää meidän foorumeilla tai käyttää lisätoimintoja. Register Now! Register Now! Its Free and Fast! Sen vapaata ja nopeaa!

Already registered? Oletko jo rekisteröitynyt? Login now below. Login nyt alla.

User Name: User Name:

Password: Salasana:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Jo rekisteröity ja Unohditko salasanasi? Click below to recover it. Klikkaa alhaalta sitä takaisin.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Liity nyt - se on nopeaa ja ilmaista!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station on suurin verkosto, tutkijat, tiedemiehet ja tieteen ystäville!

Recent Forum Posts Uusi Forum Posts

Protein Protocols Proteiini pöytäkirjat

Protein Encyclopedia Proteiini Encyclopedia

Protein Bioinformatics Protein Bioinformatics

Protein Science Forum Protein Science Forum

Protein Blog Proteiini Blog

DNA News DNA Uutiset

Bradford Protein Assay Protocol Bradford Proteiini Pitoisuus pöytäkirjan

Protein Concentration Determinatino using the Bradford Assay Method Proteiinin pitoisuus Determinatino käyttäen Bradford Pitoisuus Menetelmä

Materials for Bradford Assay Aineistot Bradford Pitoisuus

1. Reagent: The assay reagent is made by dissolving 100 mg of Coomassie Blue G250 in 50 mL of 95% ethanol. Reagenssi: Määritys reagenssi on tehty liuottamalla 100 mg Coomassie Blue G250 50 ml: aan 95% etanolia. The solution is then mixed with 100 mL of 85% phosphoric acid and made up to 1 L with distilled water. Ratkaisu on sitten sekoitetaan 100 ml 85% fosforihappoa ja enintään 1 L tislatulla vedellä. The reagent should be filtered through Whatman no. Reagenssin määrän olisi suodatettu kautta Whatman No. 1 filter paper and then stored in an amber bottle at room temperature. 1 suodatinpaperilla ja sen jälkeen varastoitu on keltaista pullo huoneenlämmössä. It is stable for several weeks. Se on vakaa useita viikkoja. However, during this time dye may precipitate from solution and so the stored reagent should be filtered before use. Kuitenkin tänä aikana väriaine se voi osoitteesta ratkaisu ja niin tallennettujen reagenssin olisi suodatettava ennen käyttöä.

2. Protein standard . Proteiini-standardia. Bovine γ-globulin at a concentration of 1 mg/mL (100 µg/mL for the microassay) in distilled water is used as a stock solution. Naudan γ-globuliini, kun pitoisuus on 1 mg / ml (100 μ g / ml koskemaan microassay) tislattua vettä käytetään varastojen ratkaisu. This should be stored frozen at –20oC. Tämä tulisi säilyttää jäädytettyinä-20oC. Since the moisture content of solid protein may vary during storage, the precise concentration of protein in the standard solution should be determined from its absorbance at 280 nm. Koska kosteuspitoisuus kiinteiden proteiini voi vaihdella varastoinnin aikana, tarkkaa keskittymistä proteiinia standardiliuos olisi määriteltävä sen absorbanssi 280 nm. The absorbance of a 1 mg/mL solution of γ-globulin, in a 1-cm light path, is 1.35. Absorbanssi on 1 mg / ml γ-globuliini, jossa 1 cm valon kulkema on 1,35. The corresponding values for two alternative protein standards, bovine serum albumin and ovalbumin, are 0.66 and 0.75, respectively. Vastaavat arvot kaksi vaihtoehtoista proteiini standardit, naudan seerumin albumiini ja albumiinin, ovat 0,66 ja 0,75 vastaavasti.

3. Plastic and glassware used in the assay should be absolutely clean and detergent free. Muovi-ja lasiastiat, joita käytetään testin pitäisi olla ehdottoman puhtaita ja pesuaineiden vapaa. Quartz (silica) spectrophotometer cuvettes should not be used, as the dye binds to this material. Quartz (piidioksidia) spektrofotometrin kyvetit ei pitäisi käyttää, sillä väriaine sitoutuu tämän materiaalin. Traces of dye bound to glassware or plastic can be removed by rinsing with methanol or detergent solution. Traces väriainekerroksella sidottu lasisia tai muovisia voida poistaa huuhtomalla metanolia tai pesuaineeseen ratkaisu.

Standard Bradford Assay Method Standard Bradford Pitoisuus Menetelmä

1. Pipet between 10 and 100 µg of protein in 100 µL total volume into a test tube. Pipetoidaan välillä 10 ja 100 μ g proteiinia 100 μ L kokonaismäärä koeputkeen. If the approximate sample concentration is unknown, assay a range of dilutions (1, 1:10, 1:100, 1:1000). Jos arvioitu näytteen pitoisuus on tuntematon, pitoisuuksiin eri laimennoksia (1, 1:10, 1:100, 1:1000). Prepare duplicates of each sample. Valmistetaan rinnakkaisnäytteet jokaisesta näytteestä.

2. For the calibration curve, pipet duplicate volumes of 10, 20, 40, 60, 80, and 100 µL of 1 mg/mL γ-globulin standard solution into test tubes, and make each up to 100 µL with distilled water. For kalibrointikäyrältä, pipetoidaan kahtena tilavuudet 10, 20, 40, 60, 80, ja 100 μ L 1 mg / ml γ-globuliini standardin liuosta koeputket ja tehdä kukin enintään 100 μ L tislatulla vedellä. Pipet 100 µL of distilled water into a further tube to provide the reagent blank. Pipetoidaan 100 μ L tislattua vettä edelleen putki antaa nollareagenssiin.

3. Add 5 mL of protein reagent to each tube and mix well by inversion or gentle vortexmixing. Lisää 5 ml proteiini reagenssia kuhunkin putkeen ja sekoitetaan hyvin käännellen tai lempeät vortexmixing. Avoid foaming, which will lead to poor reproducibility. Vältä vaahtoamista, joka johtaa huonoon toistettavuuteen.

4. Measure the A595 of the samples and standards against the reagent blank between 2 min and 1 h after mixing. Mitataan A595, näytteiden ja standardien vastaan nollareagenssiin välillä 2 min ja 1 h sekoituksen jälkeen. The 100 µg standard should give an A595 value of about 0.4. The 100 μ g standardin pitäisi antaa A595 arvo on noin 0,4. The standard curve is not linear, and the precise absorbance varies depending on the age of the assay reagent. Standardin käyrä ei ole lineaarinen, ja tarkka absorbanssi vaihtelee riippuen ikä testin reagenssi. Consequently, it is essential to construct a calibration curve for each set of assays. Näin ollen on välttämätöntä rakentaa Kalibrointikäyrä kunkin sarjan testillä.

Microassay Method This form of the assay is more sensitive to protein. Microassay Menetelmä Tämä lomake, testitulos on herkempiä proteiinia. Consequently, it is useful when the amount of the unknown protein is limited (see also Note 9). Näin ollen se on hyödyllistä, jos tuen määrä on tuntematon proteiini on rajoitettu (katso myös liitetieto 9). 1. Pipet duplicate samples containing between 1 and 10 µg in a total volume of 100 µL into 1.5-mL polyethylene microfuge tubes. Pipetoidaan kahtena näytteet sisältävät välillä 1 ja 10 μ g, jonka kokonaismäärä on 100 μ L otetaan 1,5 ml: n polyeteeni mikrofugiputkeen putkiin. If the approximate sample concentration is unknown, assay a range of dilutions (1, 1:10, 1:100, 1:1000). Jos arvioitu näytteen pitoisuus on tuntematon, pitoisuuksiin eri laimennoksia (1, 1:10, 1:100, 1:1000).

2. For the calibration curve, pipet duplicate volumes of 10, 20, 40, 60, 80, and 100 µL of 100 µg/mL γ-globulin standard solution into microfuge tubes, and adjust the volume to 100 µL with water. For kalibrointikäyrältä, pipetoidaan kahtena tilavuudet 10, 20, 40, 60, 80, ja 100 μ L 100 μ g / mL γ-globuliini standardin liuosta mikrofugiputkeen putkiin ja säätää äänenvoimakkuutta, 100 μ l vettä. Pipet 100 µL of distilled water into a tube for the reagent blank. Pipetoidaan 100 μ L tislattua vettä tulee putki nollareagenssiin.

3. Add 1 mL of protein reagent to each tube and mix gently, but thoroughly. Lisää 1 ml proteiini reagenssia kuhunkin putkeen ja sekoitetaan varovasti, mutta huolellisesti.

4. Measure the absorbance of each sample between 2 and 60 min after addition of the protein reagent. Mitataan absorbanssi jokaisen näytteen välillä 2 ja 60 min kuluttua lisäksi, että proteiini reagenssia. The A595 value of a sample containing 10 µg γ-globulin is 0.45. The A595 arvo näyte sisältää 10 μ g γ-globuliini on 0,45.

see also: Bradford Protein Assay katso myös: Joensuu Proteiinitiivisteet Pitoisuus

References for Bradford Assay Viitteet: Bradford Pitoisuus

Modified from protocol by Nicholas J. Kruger. Muutettu pöytäkirjan Nicholas J. Kruger.

Related Protein Concentration Articles Related Protein Pitoisuus artikla

Protein Concentration Proteiinin pitoisuus

Protein Concentration Protocol Proteiinin pitoisuus pöytäkirjan

Lowry Protein Assay Lowry Proteiini Pitoisuus

Lowry Method Protocol Lowry Menetelmä pöytäkirjan

Bradford Method Bradford Menetelmä

Other Protein Methods: Muut Proteiini Menetelmät:

Western Blot Western Blot

Immunoprecipitation Immunoprecipitation