Welcome to Molecular Station! Tervetuloa Molecular Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Sinun täytyy rekisteröityä ennen kuin voit lähettää meidän foorumeilla tai käyttää lisätoimintoja. Register Now! Register Now! Its Free and Fast! Sen vapaata ja nopeaa!

Already registered? Oletko jo rekisteröitynyt? Login now below. Login nyt alla.

User Name: User Name:

Password: Salasana:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Jo rekisteröity ja Unohditko salasanasi? Click below to recover it. Klikkaa alhaalta sitä takaisin.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Liity nyt - se on nopeaa ja ilmaista!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station on suurin verkosto, tutkijat, tiedemiehet ja tieteen ystäville!

Recent Forum Posts Uusi Forum Posts

PCR Protocols PCR pöytäkirjat	PCR Bioinformatics and Databases PCR Bioinformatiikka ja tietokannat	Learn about PCR Opi PCR	PCR Kits and Products PCR Kits ja Tuotteet	PCR Forum PCR-Forum	PCR Books PCR-Kirjat

Successful PCR Conditions Onnistunut PCR Conditions

Parameters for Successful PCR Parametrit onnistuneen PCR

Are you having problems of achieving a successful PCR?  Many factors can affect your outcome of your PCR such as: Metal Ion Cofactors, Substrate and Substrate Analogs, Buffers and Salts and Cosolvents.  Also Thermal Cycling Considerations:  PCR Vessels, Temperature and Time Optimization, PCR Amplification Cycles, Enzyme/Target and Hot Start. Onko sinulla ongelmia saada aikaan onnistuneita PCR? Monet tekijät voivat vaikuttaa tulokseen teidän PCR kuten: Metal Ion Cofactors, Substraatti ja Substraatti analogit, Puskurit ja suolat ja Cosolvents. Myös Thermal Pyöräily Huomioita: PCR-alukset, lämpötila-ja aika optimointi, PCR Amplification Cycles, Entsyymi / Target ja Hot Start.

Metal Ion Cofactors and PCR Metal Ion Cofactors ja PCR

An essential cofactor for the DNA polymerase in PCR is Magnesium chloride.  Its concentration must be optimized for every primer:template system. Olennainen cofactor, että DNA-polymeraasi-PCR on Magnesiumkloridi. Pitoisuus on optimoitu jokainen piste: template. Many components of the reaction bind magnesium ion, including primers, template, PCR products and dNTPs. Monet osat reaktio sitoo magnesium-ioni, mukaan lukien pohjamaaleina, malline, PCR-tuotteiden ja dNTPs. The main 1:1 binding agent for magnesium ion is the high concentration of dNTPs in the reaction. Tärkein 1:1 sideaineeseen, magnesium-ioni on korkea pitoisuus dNTPs vuonna reaktio. Because it is necessary for free magnesium ion to serve as an enzyme cofactor in PCR, the total magnesium ion concentration must exceed the total dNTP concentration. Koska se on tarpeen vapaan magnesium-ioni palvelemaan entsyymi cofactor, PCR, yhteensä magnesium-ionin pitoisuus on suurempi kuin koko dNTP keskittymä. Typically, to start the optimization process, 1.5 mM magnesium chloride is added to PCR in the presence of 0.8 mM total dNTPs. Tyypillisesti aloittaa optimoinnin, 1,5 mm magnesiumkloridi lisätään PCR, kun läsnä on 0,8 mm yhteensä dNTPs. This leaves about 0.7 mM free magnesium for the DNA polymerase. Tämä jättää noin 0,7 mm vapaata magnesium-DNA-polymeraasia. In general, magnesium ion should be varied in a concentration series from 1.5–4.0 mM in 0.5 mM steps. Yleisesti, magnesium-ioni olisi vaihteli keskittymä sarja alk. 1.5-4.0 mm 0,5 mm: n askelin.

Substrates and Substrate Analogs for PCR Substraattien ja Substraatti analogit, PCR

The DNA polymerases incorporate very efficiently dNTPs.  They also can incorporate modified substrates, when they are used as supplemental components in PCR. DNA-polymeraasien sisällyttämään erittäin tehokkaasti dNTPs. Jäsenvaltiot voivat myös sisällyttää muutettu substraattien, kun niitä käytetään lisälämpöä komponenttien PCR. Examples of substrates used for DNA polymerase are: Digoxigenin-dUTP, biotin-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP, and fluorescently labeled dNTPs. Esimerkkejä substraattien käytetään DNA-polymeraasi ovat: Digoxigenin-dUTP, biotiini-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP, ja fluorescently nimeltä dNTPs. For conventional PCR, the concentration of dNTPs remains balanced in equimolar ratios, eg, 200 μM each dNTP. Perinteisillä PCR, keskittämällä dNTPs pysyy tasapainossa equimolar suhdelukuja, esim. 200 μ M kunkin dNTP. Also note that, deviations from these standard recommendations may be beneficial in certain amplications. Huomaa myös, että poikkeamat näistä standardin suosituksia voi olla hyödyllistä tietyillä amplications. For example, when random mutagenesis of a specific target is desired, unbalanced dNTP concentrations promote a higher degree of misincorporations by the DNA polymerase. Esimerkiksi, kun satunnainen mutageneesi asettaa erityinen tavoite on toivomisen varaa, epätasapainoinen dNTP pitoisuudet edistää korkeamman asteen misincorporations että DNA-polymeraasi.

Buffers and Salts for PCR Puskurit ja suolat-PCR

Depending on the DNA polymerase used the optimal PCR buffer concentration, salt concentration, and pH should be picked accordingly to the DNA polymerase. Riippuen DNA-polymeraasi käyttää optimaalista PCR-puskuri keskittymä, suola keskittymää, ja pH: n tulisi olla poimittuja vastaavasti siten, että DNA-polymeraasi. The PCR buffer for Taq DNA polymerase consists of 50 mM KCl and 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, at room temperature. PCR-puskuria varten Taq DNA-polymeraasi koostuu 50 mM KCl ja 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, huoneenlämmössä. This buffer provides the ionic strength and buffering capacity needed during the reaction. Tätä puskuria tarjoaa ionic strength-ja puskurointikapasiteetti tarvitaan aikana reaktion. It is important to note that the salt concentration affects the Tm of the primer:template duplex, and hence the annealing temperature. On tärkeää huomata, että suola keskittymä vaikuttaa Tm, alukkeet: template duplex, ja siten hehkutus lämpötilassa.

Cosolvents

Different PCR Cosolvents are used to increase the yield, efficacy, and specificity of PCR amplifications. Eri PCR Cosolvents käytetään lisäämään tuottoa, teho ja spesifisyys PCR amplifications. These cosolvents can be advantageous in some amplifications, and disadvantageous in other amplifications. Nämä cosolvents voi olla hyödyllistä joissakin amplifications, ja epäedullinen muissa amplifications. It is impossible to predict which additive will be useful for each primer:template duplex and therefore the cosolvent must be empirically tested for each combination. On mahdotonta ennustaa, joiden lisäaineena on hyödyllistä kunkin alukkeet: template duplex ja siksi cosolvent on empiirisesti testattu kukin yhdistelmä.

Thermal Cycling Considerations Thermal Pyöräily Huomioita

PCR Vessels PCR-alukset

PCR must be performed in vessels that are compatible with low amounts of enzyme and nucleic acids and that have good thermal transfer characteristics. PCR on hoidettava alusten, jotka ovat sopusoinnussa alhaisia määriä entsyymi-ja nukleiinihapot ja että on hyvä lämpö siirtää ominaisuuksia. Usually, polypropylene is used for PCR vessels and conventional, thick-walled microcentrifuge tubes are chosen for many thermal cycler systems. Yleensä, polypropeeni käytetään PCR-alusten ja perinteisten, paksuseinäisen mikrosentrifugilla putket ovat valinneet monien lämpösyklilaitteesta järjestelmiä. PCR is most often performed at a 10–100 μL reaction scale and requires the prevention of the evaporation/condensation processes in the closed reaction tube during thermal cycling. PCR on useimmiten tehtävä on 10-100 μ L reaktion laajuus ja vaatii ehkäisemisen ja haihtuminen / kondensaatio prosessit suljettujen reaktio putken aikana lämpö-pyöräilyä. A mineral oil overlay or wax layer serves this purpose. A mineraaliöljy peitto tai vaha kerros palvelee tätä tarkoitusta varten. More recently, 0.2-mL thin-walled vessels have been optimized for the PCR process and oil-free thermal cyclers have been designed that use a heated cover over the tubes held within the sample block. Lisää äskettäin, 0,2 ml: n ohutseinäisiä alukset on optimoitu PCR-prosessia ja öljy-free thermal cyclers on suunniteltu, että käytät lämmitetty kattavat yli putkien järjestetään näytteen estää.

Temperature and Cycle Time Optimization Lämpötila ja Cycle Time optimointi

It is essential that the reaction mixtures reach the denaturation, annealing, and extension temperatures in each thermal cycle. On tärkeää, että reaktio seokset tavoittaa denaturointi, hehkutus, ja laajentamiseen lämpötilat kunkin lämpökäsittelyn. If insufficient hold time is specified at any temperature, the temperature of the sample will not be equilibrated with that of the sample block. Jos riittävää järjestää aikaa ei ole määritelty missään lämpötila, lämpötilan näyte ei tasapainottumisasteesta kanssa, että näytteen estää. Some thermal cycler designs time the hold interval based on the block temperature, whereas others base the hold time on predicted sample temperature. Jotkut lämpösyklilaitteesta mallien aika ruumassa intervalli perustuu lohkon lämpötila, kun taas toiset perustaa järjestää aikaa ennustettu näytteen lämpötilaan. If a conventional thick-walled tube used in a cycler controlled by block temperature, a 60-s hold time is sufficient for equilibration. Jos tavanomaisen paksuseinäisen putken käyttää jossakin cycler valvottava lohko lämpötila, 60-s pitää aika ei riitä equilibration. Extra time may be recommended at the (72°C) extension step for longer PCR products. Ylimääräistä aikaa voidaan suositella, (72 ° C) laajennetaan askel enää PCR-tuotteita. Using a thin-walled 0.2-mL tube in a cycler controlled by predicted sample temperature, only 15 s is required. Käyttämällä ohutseinäisiä 0,2 ml: n putkeen, joka cycler valvoo ennustettu näytteen lämpötila, vain 15 s on tarpeen. To use existing protocols or to development protocols for use at multiple laboratories, it is very important to choose hold times according to the cycler design and tube wall thickness. Voit käyttää olemassa olevia pöytäkirjoja tai kehitys-protokollien käyttö on useita laboratorioita, se on erittäin tärkeää valita pitämällä kertaa mukaan, cycler suunnittelu ja putken seinämän paksuus.

PCR Amplification Cycle Number PCR Amplification Cycle lukumäärä

The number of PCR amplification cycles should be optimized with respect to the starting concentration of the target DNA. Määrä PCR amplification syklit olisi optimoitu suhteessa alkaa keskittyminen kohde-DNA: lla. It is recommended that, from 40– 45 cycles to amplify 50 target molecules, and 25–30 cycles to amplify 3 × 105 molecules to the same concentration. On suositeltavaa, että 40-45 sykliä täydentää 50 kohdistaa molekyylejä, ja 25-30 jaksoissa, joiden tavoitteena on täydentää 3 × 105 molekyylien kanssa samaan keskittymä. This non-proportionality is caused by a so-called plateau effect, in which a decrease in the exponential rate of product accumulation occurs in late stages of a PCR. Tämä ei ole suhteellisuuden johtuu ns plateau vaikutus, joka on laskenut räjähdysmäisesti osuus tuotteen kertymistä tapahtuu myöhään vaiheissa PCR. This may be caused by degradation of reactants (dNTPs, enzyme); reactant depletion (primers, dNTPs); end-product inhibition (pyrophosphate formation); competition for reactants by non-specific products; or competition for primer binding by reannealing of concentrated (10 nM) product. Tämä voi johtua hajoamisesta reagent (dNTPs, entsyymi); reactant ehtyminen (pohjamaaleina, dNTPs); end-tuote inhibitio (pyrofosfaatti muodostuminen); kilpailu reagent muiden kuin erityisten tuotteiden tai kilpailua varten alukkeet sitovaksi reannealing tiivistetyn ( 10 nm) tuote. It is usually advisable to run the minimum number of cycles needed to see the desired specific product, because unwanted nonspecific products will interfere if the number of cycles is excessive. On yleensä suositeltavaa suorittaa vähimmäismäärä syklien tarvitaan haluamasi tietyn tuotteen, koska ei-toivotut nonspecific tuotteet häiritse, jos Työkiertojen lukumäärä on liian suuri.

Enzyme / Target Entsyymi / Kohdetasot

In a standard aliquot of Taq DNA polymerase used for a 100-μL reaction, there are about 1010 molecules. Vuonna standardin alikvoottiosasta Taq DNA-polymeraasi käytetty: 100 - μ L reaktion, on noin 1010 molekyylejä. Each PCR sample should be evaluated for the number of target copies it contains or may contain. Jokainen PCR-näyte olisi arvioitava, kuinka monta kohdistaa kappaleena se sisältää tai voi sisältää. For example, 1 ng of lambda DNA contains 1.8 × 107 copies. Esimerkiksi 1 ng Lambda DNA sisältää 1,8 × 107 kappaletta. For low-input copy number PCR, the enzyme becomes limiting and it may be necessary to give the extension process incrementally more time. Saat vähän torjunta-aineita kopioida useita PCR-, entsyymi tulee rajoittaa, ja se voi olla tarpeen antaa laajentaminen prosessi asteittain enemmän aikaa. Thermal cyclers can reliably perform this automatic segment extension procedure in order to maximize PCR yield. Thermal cyclers voi luotettavasti suorittaa tämän automaattisen segmentin laajentaminen menettely, jotta voidaan maksimoida PCR tuottoa.

Hot Start Conditions Hot Start Conditions

All of the above optimizations also apply to a PCR that is designed, from the beginning, with a hot start method. Kaikki edellä optimointeja sovelletaan myös PCR, joka on suunniteltu alusta alkaen, jolloin kuuma aloittaa menetelmällä. Often, a hot start can be incorporated successfully into a previously optimized PCR without changing the reaction conditions. Usein kuuma alkaa voidaan sisällyttää onnistuneesti aiemmin optimoitu PCR muuttamatta reaktio-olosuhteet. However, it usually pays to reoptimize after adding a hot start. Kuitenkin se yleensä maksaa reoptimize kuluttua lisäämällä kuumaa alkua. Optimization is often a balance between producing as much product as possible and overproducing nonspecific, background amplifications. Optimointi on usein tasapaino tuottaa niin paljon tuotetta kuin mahdollista ja overproducing nonspecific, tausta amplifications. Because hot start greatly reduces background amplifications, the upper restraints are raised on conditions such as enzyme concentration, cycle number, and metal ion cofactor concentration. Koska kuuma aloittaa suuresti vähentää tausta amplifications, ylempi rajoitukset ovat esittäneet ehdoista, kuten entsyymin pitoisuus, pyöräile numero, ja metalli-ionin cofactor keskittymä. Sensitive PCRs that have been highly tuned without a hot start may fail when a hot start is added. Herkät PCRs, että on hyvin viritetty ilman kuumaa aloittaa voi epäonnistua, kun on kuuma alku on lisätty. This can be caused by slight delays in early cycles caused by mixing or enzyme activation. Tämä voi johtua viiveet alussa syklit aiheuttaman sekoittumisen tai entsyymin aktivoitumisen. The PCR usually can be restored, often with substantial increase in specific product, by simply increasing limiting parameters or reagents. PCR yleensä voidaan palauttaa, joissa on usein huomattava kasvu tietyn tuotteen, yksinkertaisesti lisäämällä rajoittaa parametrit tai reagensseja. In addition, there are optimizations specific to each hot start method. Lisäksi on olemassa optimointeja kunkin hot start-menetelmällä. Mixing or enzyme activation can be affected by PCR volume, buffer composition and pH, cosolvents, cycling conditions, and so on. Sekoittamista tai entsyymin aktivaatio voidaan vaikuttaa PCR-määrä, puskuri koostumus ja pH, cosolvents, pyöräilyn olosuhteet, ja niin edelleen. The specific product’s literature, often a product insert, should be consulted for information on these considerations. Määrätyn tuotteen n kirjallisuus, usein tuotteen lisätä, olisi kuultu tietoja näistä seikoista.