home > pcr > history-of-pcr > index.php etusivu> PCR-> Historia-PCR-> index.php
 |
|---|
 |  |  |  |  | |
|---|---|---|---|---|---|
PCR Protocols PCR pöytäkirjat | PCR Bioinformatics and Databases PCR Bioinformatiikka ja tietokannat | Learn about PCR Opi PCR | PCR Kits and Products PCR Kits ja Tuotteet | PCR Forum PCR-Forum | PCR Books PCR-Kirjat |
Also visit PCR Station Myös käydä PCR Station
Copyright 2006 MolecularStation Copyright 2006 MolecularStation
Polymerase Chain Reaction - PCR Polymeraasiketjureaktio - PCR
Table of Contents : Sisällysluettelo:
Introduction to PCR - Polymerase Chain Reaction Johdatus PCR - Polymeraasiketjureaktio
Polymerase Chain Reaction (PCR) Polymeraasiketjureaktio (PCR)
PCR, a Concept to be Discovered PCR-, käsite olisi voitu havaita
General Principles of the PCR General Principles, PCR
Polymerases/Reaction Specificity and Efficiency Polymeraasien / reaktion spesifisyydestä ja tehokkuus
PCR and Molecular Cloning PCR ja molekyylibiologian Kloonaus
Misincorporation: Errors of In Vitro Systems Misincorporation: Virheet in vitro-Systems
Reaction Specificity Reaktion spesifisyydestä
Major Advantages of PCR as a Cloning Method include its Rapidity, Sensitivity, and Robustness Merkittäviä etuja PCR kuin Kloonaus Menetelmä sisällyttää sen nopeus, herkkyys, ja häiriönsietoa
Limitations of PCR Rajoitukset PCR
Instruments for PCR Instrumentit PCR
Oligonucleotide Synthesis Oligonucleotide Synthesis
Will PCR ever be replaced? Will PCR koskaan korvata? – Helicase-dependent Amplification (HDA) -- Helicase riippuvaisten Amplification (hda)
More than 30 years ago, the introduction of recombinant DNA technology as a tool for the biological sciences revolutionized the study of life. Molecular cloning allowed the study of individual genes of living organisms; however this technique was dependent on obtaining a relatively large quantity of pure DNA. This depended on the replication of the DNA of plasmids or other vectors during cell division of microorganisms (1). Researchers found it extremely laborious and difficult to obtain a specific DNA in quantity from the mass of genes present in a biological sample (2). Recombinant DNA technology made possible the first molecular analysis and prenatal diagnosis of several human diseases. Fetal DNA obtained by amniocentesis sampling could be analyzed by restriction enzyme digestion, electrophoresis, southern transfer and hybridization to a cloned gene or oligonucleotide probes (3). However, southern blotting permitted only rudimentary mapping of genes in unrelated individuals (4). Yli 30 vuotta sitten, että olisi otettava käyttöön yhdistelmä-DNA-tekniikalla, jonka avulla biologiset tieteet mullistanut tutkimuksen elämää. Molecular kloonaus sallitaan tutkimuksessa yksittäisten geenien eläviin organismeihin, mutta tämä menetelmä on riippuvainen saada suhteellisen suuri määrä puhdasta DNA: ta. Tämä riippui replication, DNA-plasmidit tai muiden vektoreiden aikana solujen jakautumisen mikro-organismien (1). Tutkijat pitivät erittäin työläs ja vaikea saada tietyn DNA: n määrä massa geenien läsnä biologinen näyte (2 ). Rekombinantti DNA-teknologia mahdollisti ensimmäisen molekyylitason analyysi ja prenataaliseen diagnoosiin useiden ihmisten sairauksia. Sikiön DNA saadaan amniocentesis näytteenotto voidaan analysoidaan restriktioentsyymianalyysillä entsyymin ruoansulatukseen, elektroforeesi, Etelä-siirron ja hybridization on kloonattu geeni tai oligonukleotidi anturit (3). Kuitenkin Etelä-blotting sallittua vain alkeellisia kartoitus geenien etuyhteydettömille yksilöiden (4).
PCR, an acronym for Polymerase Chain Reaction (5,6), allowed the production of large quantities of a specific DNA from a complex DNA template in a simple enzymatic reaction. PCR is a recently developed procedure for the in vitro amplification of DNA. PCR has transformed the way that almost all studies requiring the manipulation of DNA fragments may be performed as a results of its simplicity and usefulness (7). PCR, lyhenne Polymeraasiketjureaktio (5,6), sallitaan tuotantoon suuria määriä tiettyä DNA: monimutkaisen DNA-malli on yksinkertainen entsymaattisen reaktion. PCR on viime aikoina kehitetty menettely, in vitro-amplification DNA. PCR on muuttanut siten, että lähes kaikki tutkimukset edellyttävät manipuloinnin DNA-fragmentit voidaan suorittaa kuin tulokset sen yksinkertaisuuden ja hyödyllisyyden (7).
In the 1980s, Kary Mullis (Figure 1) and a team of researchers at Cetus Corporation at Cetus Corporation conceived of a way to start and stop a polymerase's action at specific points along a single strand of DNA. Mullis also realized that by harnessing this component of molecular reproduction technology, the target DNA could be exponentially amplified. This DNA amplification procedure was based on an in vitro rather than an in vivo process (5,6,8). Cell-free DNA amplification by PCR was able to simplify many of the standard procedures for cloning, analyzing, and modifying nucleic acids (1). Previous techniques for isolating a specific piece of DNA relied on gene cloning – a tedious and slow procedure. PCR, on the other hand Kerry Mullis stated “lets you pick the piece of DNA you’re interested in and have as much of it as you want” (2,8). Vuonna 1980, Kary Mullis (kuvio 1) ja joukko tutkijoita on Cetus Corporation on Cetus Corporation suunniteltaessa on tapa aloittaa ja lopettaa polymeraasiketjureaktiojärjestelmällä n toimia yksittäisiä kohtia pitkin yhtenä osa DNA: ta. Mullis myös tajusi, että otat tämän osa - Molekulaarisen kopiointi teknologia, kohde-DNA: lla voisi olla eksponentiaalisesti vahvistamista. Tämä DNA amplification menettely perustui in vitro eikä in vivo-prosessi (5,6,8). Cell-free-DNA amplification, PCR pystyi yksinkertaistamiseksi monia standardin menettelyjä kloonaus, analysoimalla ja muuttamalla nukleiinihapot (1). Edellinen tekniikoita, jotka eristävät tietyllä pala DNA vetosi geenien kloonaus - tylsiä ja hidas menettely. PCR, toisaalta Kerry Mullis totesi "voit valita pala DNA olet kiinnostunut ja ovat niin paljon kuin haluat "(2,8). When other Cetus scientists eventually succeeded in making the polymerase chain reaction perform as desired in a reliable fashion, they had an immensely powerful technique for providing essentially unlimited quantities of the precise genetic material molecular biologists and others required for their work (8). Since the first report in1985, more than 5000 scientific papers were published by 1992 (1). Furthermore, the large number of publications of course makes it impossible to review all the important contributions to the development and application of PCR technology; however we will attempt to review here the most important developments in the practice of basic PCR. Kun muut Cetus tiedemiehet lopulta onnistunut tekemään Polymeraasiketjureaktio suorittamansa toivomisen luotettava muotia, ne oli valtavan voimakas tekniikka, joka tarjoaa lähinnä rajoittamattoman määrän tarkan geneettisen materiaalin molekyyli biologit ja muut vaaditut heidän työstään (8). Koska Ensimmäinen kertomus in1985, yli 5000 tieteellisten asiakirjojen julkaistiin 1992 (1). Lisäksi lukuisat julkaisut tietenkin tekee mahdottomaksi tarkastella kaikkia tärkeitä osuuksia kehittäminen ja soveltaminen PCR-tekniikka, mutta meidän tulee yrittää uudelleen tässä tärkein käytännössä tapahtunut kehitys perusasetuksen PCR.
PCR was thought to be conceived by Dr. Kerry Mullis in 1983 while working at the Cetus Corporation in Emeryville, CA. However, some pioneering work was also done by Gobind Khorana in 1971 who described a basic principle of replicating a piece of DNA using two primers. Progress then was limited by primer synthesis and polymerase purification issues (9). In Mullis’s head, the invention grew from a theoretical scheme to perform limited dideoxynucleotide sequencing of unique human genes using synthetic oligonucleotides for the purpose of diagnosing common human disease mutations. An obvious obstacle to such a direct sequencing strategy was the high complexity of the human genome (3.3 X 109 base pairs). Thus, a second oligonucleotide or primer was added to block the progression of the synthesis of the first primer. Later however, this second primer was included to bind to the other DNA strand, so that each strand of the mutant allele would contribute to the eventual signal. If the scheme involving simultaneous hybridization of primers to each strand was modified by heating the mixture and then repeating the annealing and extension steps, then the primary signal would be increased even further. Repeating the steps would enable the products of the first round to be duplicated in the second cycle, to yield two copies. Repeating the cycle again would result in four copies, et cetera . Several weeks passed before this great idea was attempted (8). Two primers were synthesized to be perfectly complementary to each end of the 110 base pair region of a cloned segment of the human b-globin gene, the amplification was performed, and the products were identified by acrylamide gel electrophoresis. The end result was the anticipated 110 base pair DNA fragment and the beginning of PCR as a basic technique in molecular biology (5,6). PCR oli ajatellut on suunniteltu Dr. Kerry Mullis vuonna 1983, kun taas Työskentely Cetus Oyj Emeryville, CA. Kuitenkin jotkut uraauurtavaa työtä on myös tehtävä Gobind Khorana vuonna 1971 jotka kuvattu perusperiaatteena kahdentamaan palanen DNA käyttämällä kahta alukkeita. Edistystä oli tuolloin rajallinen, alukkeet synteesi ja polymeraasi puhdistus kysymyksiä (9). Mullis pää, keksintö kasvoi teoreettinen järjestelmä suorittaa rajoitetun dideoxynucleotide sekvensointi ainutlaatuisen ihmisen geenejä käytetään synteettistä oligonucleotides varten diagnosoinnissa yhteisen ihmisen sairauksien mutaatioita. Yksi ilmeinen este tällainen suora sekvensointi strategia oli korkea monimutkaisuus ihmisen genomista (3,3 x 109 base paria). Näin ollen toisen oligonukleotidi tai alukkeet on lisätty estää etenemistä synteesissä ensimmäisen esikäsittelyaineella. Myöhemmin kuitenkin , Tämän toisen alukkeet on sisällytetty sitoutuvan muiden DNA-lohkoon siten, että kunkin lohkon on mutantti alleeli auttaisi mahdollinen signaali. Jos järjestelmää, jossa samanaikaisesti hybridization alukkeiden kunkin lohkon muutettiin lämmittämällä seos ja sitten toistaa hehkutus ja laajentamista toimiin, niin ensisijainen signaali olisi kasvanut entisestään. toistamalla vaiheet mahdollistaisi sen, että tuotteet ensimmäisellä kierroksella voidaan monistaa ja toisessa vaiheessa, tuottaa kaksi kappaletta. toistamasta sykli jälleen johtaisi neljänä kappaleena, et cetera. Useat viikkoa eteenpäin ennen kuin tämä idea oli yrittänyt (8). Kaksi pohjamaaleina olivat syntesoiduista on täysin täydentävät kunkin lopussa yhteensä 110 Emäspari alueen kloonatun segmentti ihmisen b-globin geeni, amplification on suoritettu, ja tuotteet tunnistetaan akryyliamidin geelielektroforeesilla. Lopputuloksena oli ennakoitu 110 Emäspari DNA-fragmentti ja alussa PCR kuin perustason tekniikkaa, molekyylibiologia (5,6).
In Mullis's original PCR process(5,6,8), the enzyme was used in vitro (in a controlled environment outside an organism). Vuonna Mullis alkuperäisen PCR-prosessia (5,6,8), entsyymi on käytetty in vitro (valvotussa ympäristössä, että organismin ulkopuolella). The double-stranded DNA was separated into two single strands by heating it to 96°C. The double-stranded DNA oli jaettu kahden yksittäisen osa-kuumentamalla sitä 96 ° C. At this temperature, however, the E.Coli DNA polymerase was destroyed so that the enzyme had to be replenished after the heating stage of each cycle. Tässä lämpötilassa, mutta E. coli DNA-polymeraasi tuhoutui niin, että entsyymi olisi täydennettävä, kun lämmitys vaiheessa jokaisella kierroksella. Mullis's original PCR process was very inefficient since it required a great deal of time, vast amounts of DNA-Polymerase, and continual attention throughout the PCR process. Mullis alkuperäisen PCR-prosessi oli varsin tehotonta, koska se vaati paljon aikaa, valtavia määriä DNA-polymeraasiketjureaktion, ja jatkuvaa huomiota koko PCR-prosessia.
Examination of the PCR amplification mechanism reveal its simplicity but also its elegance (Figure 2). Oligonucleotide primers are first designed to be complementary to the ends of the sequence to be amplified, and then mixed in molar excess with the DNA template and deoxyribonucleotides in an appropriate buffer. Following heating to denature the original strands and cooling to promote primer annealing, the oligonucleotides each bind to a different strand of the target fragment. The primers are positioned so that when each is extended by the action of a DNA polymerase, the newly synthesized strands will overlap the binding site of the opposite oligonucleotide. As the process of denaturation, annealing, and polymerase extension is continued the primers repeatedly bind to both the original DNA template and complementary sites in the newly synthesized strands and are extended to produce new copies of DNA (Figure 3). The end result is an exponential increase in the total number of DNA fragments that include the sequences between the PCR primers, which are finally represented at a theoretical abundance of 2n, where n is the number of cycles (1,7,13). Tutkiminen PCR amplification mekanismi paljastaa sen yksinkertaisuus, mutta myös sen eleganssia (kuvio 2). Oligonucleotide pohjamaalit ovat ensimmäiset, joiden tarkoituksena on täydentää päihin järjestysnumero on täydennetty, ja sitten sekoittaa molar ylittävät kanssa DNA-malli ja deoxyribonucleotides on asianmukaiset puskuriin. jälkeen lämmitys laimentavat alkuperäinen osa ja jäähdytyksen edistämiseksi alukkeet hehkutus, oligonucleotides kunkin kehon eri osa kohde-fragmentti. pohjamaaleina on sijoitettava niin, että kun jokainen on jatkettu toiminnan DNA-polymeraasi, vastavalitun syntesoiduista osa on päällekkäisiä sitova sivuilla päinvastainen oligonukleotidi. prosessi denaturointi, hehkutus, ja polymeraasi laajentaminen on jatkanut pohjamaaleina toistuvasti sitomana sekä alkuperäistä DNA-malli ja täydentävä sivustoja vasta syntesoiduista lohkoon ja ne laajennetaan tuottaa uusia kopioita DNA (kuvio 3). Lopputuloksena on eksponentiaalinen kasvu kokonaismäärästä DNA-fragmentit, jotka sisältävät sekvenssien välillä PCR-alukkeet, jotka ovat lopulta edustettuna teoreettinen runsaasti 2n, missä n on määrä sykliä (1 , 7,13).
A DNA polymerase is a naturally occurring enzyme, a biological macromolecule that catalyzes the formation and repair of DNA. DNA-polymeraasi on luonnossa esiintyvä entsyymi, biologinen makromolekyylistä, että catalyzes muodostumista ja korjaus DNA: ta. It works by binding to a single DNA strand and creating a complementary strand. Se toimii sitoutumalla yhden DNA-lohkoon ja luoda täydentäviä lohkoon. The accurate replication of all living matter depends on this activity, where it functions to duplicate DNA when cells divide (10,11). Only recently have scientists learned to manipulate this activity and apply it to scientific research. The earliest PCR experiments utlilized the Klenow fragment of Escherichia coli DNA polymerase I at a temperature of 37C to amplify specific targets from human genomic DNA (5,6). Often these PCR reactions produced incompletely pure target product as judged by gel electrophoresis (1). These initial PCR amplifications with the Klenow fragment were not highly specific (5,6). Although a unique DNA fragment could be amplified ~200,000 fold from genomic DNA, only about 1% of the PCR product was the targeted sequence (13). A specific hybridization probe was required to analyse the amplified DNA (5,6). Tarkka replication kaikkien elävien asia riippuu tästä toiminnasta, jossa se toimii rinnalle DNA kun solujen kahtiajaon (10,11). Vasta viime aikoina ovat tiedemiehet oppivat manipuloimaan tätä toimintaa ja soveltavat sitä tieteellistä tutkimusta. Aikaisin PCR kokeiluja utlilized, Klenow fragmentti, Escherichia coli DNA-polymeraasi I lämpötilassa 37c täsmentää erityisiä tavoitteita ihmisen geenien DNA (5,6). Usein nämä PCR-reaktioita tuotettu epätäydellisesti puhdasta kohdistaa tuotteen arvioidaan geelielektroforeesilla (1). Näissä ensimmäisissä PCR amplifications kanssa Klenow fragmentti ei ollut erittäin (5,6). Vaikka ainutlaatuinen DNA-fragmentti voi korostua ~ 200000 fold osoitteesta geenien DNA, vain noin 1%: n PCR-tuote oli kohdennettuja sekvenssi (13). Erityinen hybridization koetin oli velvollinen analysoida entistä laajempi DNA (5,6).
Some PCR conditions were determined to increase the stringency of primer hybridization such as lower MgCl2 concentrations and higher annealing temperatures. Jotkut PCR-olosuhteet olivat päättäneet lisätä tiukentuvista alukkeet hybridization, kuten alhaisempi MgCl2: ta pitoisuudet ja korkea-hehkutus lämpötiloissa.
Furthermore, the concentration of enzyme and primers, the annealing time, extension time, and number of PCR cycles all were found to effect the specificity of the PCR. Lisäksi keskittyminen entsyymi-ja pohjamaalit, hehkutus aika-, laajennus-aikaa, ja useita PCR-syklien kaikki olivat voimaantulon erityispiirteet PCR.
Also, the concentration of a specific sequence in a sample can also influence the relative homogeneity of the PCR products (1,7,13,14,15). Deoxyribonucleotide triphosphates and magnesium in an appropriate buffer are also important ingredients for PCR. The efficiency and specificity of PCRs can be affected by variations in the concentration and ratio of free magnesium, deoxyribonucleotide triphosphates, and primers. Myös keskittyminen tiettyyn sekvenssi, näyte voidaan myös vaikuttaa suhteellinen homogeenisuus PCR-tuotteiden (1,7,13,14,15). Deoxyribonucleotide trifosfaatit ja magnesiumia sopivassa puskuri ovat tärkeitä myös ainesosien PCR. Tehokkuus ja spesifisyys PCRs voidaan vaikuttaa vaihtelut keskittymä ja suhde vapaa-magnesium-, deoxyribonucleotide trifosfaatit, ja pohjusteet. These reagents must be optimized in order to achieve high specificity and yield (14). It was also discovered that the effect of temperature and oligonucleotide primer length on the specificity and efficiency of amplification by the polymerase chain reaction (15). Nämä reagenssit on optimoitu, jotta voidaan saavuttaa korkea spesifisyys ja sato (14). Lisäksi havaittiin, että vaikutus lämpötila-ja oligonukleotidi alukkeet pituus erityispiirteet ja tehokkuuden vahvistaminen, Polymeraasiketjureaktio (15).
The inactivation of the Klenow fragment of Escherichia coli DNA polymerase I at the high temperature required for strand separation required the addition of enzyme after the denaturation step of each cycle (5,6). Prior to 1988, anyone conducting a PCR reaction procedure was obliged to sit patiently by a series of water baths or heating blocks and add a fresh aliquot of E.Coli DNA polymerase after each denaturation step, which was typically carried out by immersing the reaction vessel in boiling water for ½ a minute to 3 minutes (7). This rather tedious step was eliminated by the introduction of a thermostable DNA polymerase, the Taq DNA polymerase (12) once, at the beginning of the PCR reaction. The thermostable properties of the DNA polymerase activity were isolated from Thermus aquaticus (Taq) (Figure 4) that grow in geysers of over 110C, and have contributed greatly to the yield, specificity, automation, and utility of the polymerase chain reaction (1,7,12). The Taq enzyme can withstand repeated heating to 94C and so each time the mixture is cooled to allow the oligonucleotide primers to bind the catalyst for the extension is already present (1,7). However, higher annealing temperatures were not established until the single “most important development of PCR development” (8), the purification and commercial distribution of a heat-resistant DNA polymerase from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus ( Taq ) (12). Inaktivointi, Klenow-fragmentti, Escherichia coli DNA-polymeraasi I korkeaa lämpötilaa tarvitaan lohkon erottaminen edellytti lisäksi entsymaattisten jälkeen denaturointi askel kunkin syklin aikana (5,6). Ennen 1988, kuka tahansa suorittaa PCR-reaktio oli pakko istumaan kärsivällisesti joukko veden ammet tai lämmitys-korttelin ja lisätä tuore erä E. coli-bakteerien DNA-polymeraasi jälkeen kunkin denaturointi askel, joka on yleensä suoritettava immersing reaktio aluksen kiehuvaa vettä ½ minuuttia 3 minuuttia (7 ). Tämä melko tylsiä askel oli poistettava ottamalla käyttöön jonkin Termostabiilit DNA-polymeraasi, Taq DNA-polymeraasi (12) kerran, alussa PCR-reaktion. Termostabiilit ominaisuudet DNA-polymeraasi toiminta oli eristetty Thermus aquaticus (Taq) (Kuvio 4) kasvaa geysers yli 110 c, ja ne ovat edistäneet merkittävästi tuotto, spesifisyys, automaatio-, ja hyöty, Polymeraasiketjureaktio (1,7,12). Taq-entsyymi voi kestämään toistuva lämmitys 94 c ja niin joka kerta, kun seos on jäähtynyt, jotta oligonukleotidi pohjamaaleina sitovasti katalysaattorina laajennus on jo läsnä (1,7). kuitenkin korkeampi hehkutus lämpötilat eivät ole sijoittautuneet siihen asti, kunnes single "tärkein kehittämistä PCR kehittäminen" (8), puhdistus-ja kaupallinen jakelu, lämmönkestävällä DNA-polymeraasi, termofiilisten bakteeria Thermus aquaticus (Taq) (12).
The isolation of a heat-resistant DNA polymerase also allowed primer annealing and extension to be carried out at elevated temperatures (1,7,12,13), thereby reducing mismatched annealing to nontarget sequences (non-specific amplification) or increasing specificity. In this way, for many amplifications the PCR product could be detected as a single ethidium bromide-stained band on an electrophoretic gel (12). This increased specificity also increased DNA yield of the target sequence. Moreover, longer PCR products could be amplified from genomic DNA, probably due to a reduction in the secondary structure of the template strands at the elevated temperature used for primer extension. The upper size limit for Klenow fragment polymerase amplification was only about 400bp. Taq polymerase and other thermostable polymerases have synthesized fragments up to 10 kb (1,7,12,13). The availability of Taq polymerase has also greatly simplified the automation of the reaction as it is a much easier task to construct an apparatus that will cycle a reaction tube through different temperatures than to manufacture a device that would perform both the thermocycling and the addition of enzyme aliquots. Currently there is a great variety of thermocyclers available commercially. This development has been a significant factor in the rapid application of this technology by the scientific community (7). Eristyneisyys, lämmönkestävällä DNA-polymeraasi sallitaan myös alukkeet hehkutus ja laajentaminen on suoritettava korkeissa lämpötiloissa (1,7,12,13), mikä vähentää paritonta hehkutus on nontarget sekvenssien (non-amplification) tai lisäämällä erityisyyttä. Tällä tavoin monet amplifications PCR-tuote voi olla havaittu yhden ethidium bromidi-värjättyä bändi, joka elektroforeesi-geeli (12). Tämä lisäsi erityisyyttä myös lisännyt DNA-saanto kohteena järjestyksessä. Lisäksi enää PCR-tuotteet saattavat korostua, Genova DNA, johtunee vähentämisestä jälkimarkkinoilla rakenne mallipohjan osa on kohonnut lämpötila käytetyt alukkeet laajentamista. Ylempi koon raja Klenow fragmentti polymeraasi vahvistinpiirejä oli vain noin 400bp. Taq-polymeraasia ja muita Termostabiilit polymeraasien on syntesoiduista fragmentit enintään 10 kb (1,7,12,13). saatavuus Taq-polymeraasia on myös huomattavasti yksinkertaistettu automatisointia ja reaktio koska se on paljon helpompi tehtävä rakentaa laite, joka sykli reaktio putken kautta eri lämpötiloissa kuin valmistuksen laitteen , joka suorittaa sekä thermocycling ja lisäämällä entsyymin erää. Tällä hetkellä on olemassa suuri määrä erilaisia thermocyclers kaupallisesti saatavilla. Tämä kehitys on ollut merkittävä tekijä nopeaa soveltamista tämän teknologian tiedeyhteisö (7).
In addition to the production of double-stranded, blunt-ended DNA fragments which may be formed by PCR, two other features of the PCR scheme contribute greatly to the utility of PCR. First, the position of binding of the primers defines the boundaries of the amplified fragment and therefore the prior molecular cloning requirement of restriction endonuclease recognition sites is not required for PCR. As only a limited number of DNA sequences are restriction sites, PCR greatly increases the flexibility of choice of fragment size and composition. Secondly, it is not necessary for PCR oligonucleotides to be exactly complementary to the template DNA. “Tails” may be added to the 5’ end of the primer to introduce sequences within the priming sites which thus may be exploited to introduce restriction endonuclease recognition sites or other useful sequences such as mutations into the amplified DNA. This phenomena allowed the emergence of PCR as a method for rapid DNA cloning (1,7,13). Sen lisäksi, että tuotanto double-stranded, tylppiä-päättyi DNA-fragmentit, jotka voidaan muodostaa PCR-menetelmällä, kaksi muuta piirteitä PCR-järjestelmä vaikuttaa merkittävästi käyttökelpoisuutta PCR. Ensiksikin kannan sitovia, pohjamaaleja määritellään rajat on täydennetty fragmentti ja siksi ennen molekyyli kloonaus vaatimus rajoitus endonuclease tunnustamista sivustoja ei vaadita PCR. kuin vain rajoitetun määrän DNA-sekvenssit ovat rajoitus-sivustot, PCR lisää joustavuutta valita fragmentti koosta ja kokoonpanosta. Toiseksi, se on ole tarpeen PCR oligonucleotides on täsmälleen täydentävät mallipohjan DNA: ta. "Pyrstö" voidaan lisätä 5 "loppuun, alukkeet ottaa käyttöön sekvenssien kanssa esikäsittely sivustoista, jotka näin ollen voivat olla hyväksi ottaa käyttöön rajoitus endonuclease tunnustamista sivustoja tai muita hyödyllisiä sekvenssien kuten mutaatiot osaksi täydennetty DNA. ilmiöiden sallittu syntymistä PCR kuin menetelmän nopea DNA kloonauksen (1,7,13).
Molecular cloning has benefited from the emergence of PCR as a technique. Direct cloning was first conducted using a 110 bp DNA fragment amplified by PCR and oligonucleotide primers which contained restriction endonuclease recognition sites added to their 5’ ends. These sites were used to facilitate cloning of the amplified DNA into an M13 plasmid (17). The 110 bp fragment was also sequenced to confirm that this approach was a rapid yet reliable approach to cloning. (Figure 5) Molecular kloonaus on hyötynyt syntymistä PCR kuin tekniikka. Suora kloonaus on ensiksi suoritetaan käyttäen 110 emäsparin DNA-fragmentti korostua PCR-ja oligonukleotidi pohjamaaleina, joka sisälsi rajoitus endonuclease tunnustamista sivustoja lisätään niiden 5 'päättyy. Nämä alueet olivat käytetään helpottamaan kloonaus on täydennetty DNA osaksi M13 plasmidia (17). 110 bp-fragmentti oli myös jaksotettava vahvistaa, että tämä lähestymistapa on nopeasti vielä luotettavia lähestymistapa kloonausta. (kuvio 5)
Cell-based DNA cloning involves DNA replication in vivo, which is associated with a very high fidelity of copying because of proofreading mechanisms. However, when DNA is replicated in vitro as with PCR, the copying error rate is considerably greater. The most widely used polymerase, Taq DNA polymerase however, has no associated 3’to 5’ exonuclease to confer a proofreading function. Thus the error rate due to base misincorporation during DNA replication is rather high for Taq : for a 1 kb sequence that has undergone 20 effective cycles of duplication, approximately 40% of the new DNA strands synthesized by PCR using this enzyme will contain an incorrect nucleotide resulting from a copying error (16). Cell-pohjainen DNA kloonauksen liittyy DNA replication in vivo, joka liittyy hyvin High Fidelity kirjoitusvirheiden takia oikoluku mekanismeja. Kuitenkin, kun DNA on toisinnettava in vitro kuten PCR-, kopiointi virheprosentti on huomattavasti suurempi. Yleisimmin käytetty polymeraasi, Taq DNA-polymeraasi kuitenkaan ole liittyvät 3'to 5 'exonuclease, antavat oikoluku funktio. Niinpä virheprosentti johtuu base misincorporation aikana DNA replication on melko korkea Taq:: 1 kb sekvenssi, joka on tehty 20 tehokkaita syklit päällekkäisyyksiä, noin 40%: n uusi DNA osa syntesoiduista PCR-menetelmällä käyttäen tämän entsyymin sisältää virheellisen nukleotidien johtuvat kopiointi virhe (16). Therefore, even if the PCR reaction involves amplification of a single DNA sequence, the final product will be a mixture of almost matching, but not identical DNA sequences. Despite the errors due to replication in vitro , DNA sequencing of the total PCR product may give the correct sequence due to the fact that the incorporation of incorrect bases is essentially random and the contribution of one incorrect base on one or more strands is overwhelmed by the contributions from the huge majority of strands which will have the correct sequence. However, if the PCR product is to be cloned in cells, several individual clones may need to be sequenced in order to determine the correct (consensus) sequence, prior to conducting further experiments. Näin ollen, vaikka PCR-reaktion liittyy vahvistinpiirejä yhdestä ainoasta DNA-sekvenssi, että lopullinen tuote on sekoitus lähes vastaavia, mutta eivät täysin samoja DNA-sekvenssejä. Huolimatta virheet johtuvat replikaation in vitro, DNA-sekvensointi koko PCR-tuote voi antaa oikea järjestys johtuu siitä, että yhtiöjärjestyksessä virheellisten perustoista on lähinnä satunnaisia ja panos yhden virheellisen perustaa yksi tai useampi osa on ylikuormitu, jonka osuuksista valtava enemmistö toimintalinjaa, jotka on oikea järjestys. Kuitenkin, jos PCR-tuote on kloonattu soluihin, useita yksittäisiä klooneja voidaan joutua järjestyksessä, jotta voidaan määrittää oikea (konsensus) sekvenssi, ennen suorittaa vielä kokeiluja.
More recently, the problem of infidelity of DNA replication during the PCR reaction has been considerably reduced by using alternative heat-stable DNA polymerases which have associated 3’ to 5’ exonuclease activity. Pyrococcus furiosus ( Pfu ) DNA polymerases and Thermococcus Litoralis (VENT) are becoming more widely used because of the proofreading conferred by their associated 3’ to 5’ exonuclease activity (18). The resulting PCR product of Pfu for example, has a much lower level of mutations introduced by copying errors: for a 1 kb segment of DNA that has undergone 20 effective cycles of duplication, about 3.5% of the DNA strands in the product carry an altered base (16). Hiljattain on ongelma, epäuskoa DNA replication aikana PCR-reaktio on ollut huomattavasti vähennettävä käyttämällä vaihtoehtoisia Lämpökestävän DNA-polymeraasien, jotka ovat assosioituneet 3 '5' exonuclease toimintaa. Pyrococcus furiosus (Pfu) DNA-polymeraasien ja Thermococcus litoralis (VENT) käytetään yhä laajemmin, koska sen oikoluku, joita niihin liittyvien 3 '5' exonuclease toiminta (18). tuloksena PCR tuotteen Pfu on esimerkiksi huomattavasti alhaisempi mutaatioita käyttöön kopioimalla virheet:: 1 kB segmentti DNA: n, joka on tehty 20 tehokkaita syklit päällekkäisyyksiä, noin 3,5%: n DNA-osa kyseisen tuotteen mukanaan muuttaa base (16).
New approaches to improve specificity have been developed based on the recognition that the Taq DNA polymerase retains considerable enzymatic activity at temperatures well below the optimum for DNA synthesis. Thus, primers annealing non-specifically to a partially single stranded template region can be extended before the reaction reaches 72°C for extension of specifically annealed primers. If the DNA polymerase is activated only after the reaction has reached high (>70°C) temperatures, non-target amplification can be minimized (19,20). This “Hot start” approach can be accomplished by manual addition of an essential reagent to the selection tube at elevated temperatures. The addition of ssDNA binding protein has also been reported to increase specific amplification. A more user friendly approach is to use either inhibition or inactivation of the DNA polymerase itself. Uusi lähestymistapa parantaa spesifisyys on kehitetty perustuu sen tunnustamiseen, että Taq DNA-polymeraasi säilyttänyt huomattavan entsymaattisen aktiivisuuden lämpötiloissa, reilusti alle optimaalisen DNA-synteesiä. Näin ollen pohjamaaleina hehkutus ei ole nimenomaan osittain ainoa stranded template alueella voidaan pidentää ennen reaktio saavuttaa 72 ° C: n laajentamista nimenomaan annealed pohjamaaleihin. Jos DNA-polymeraasi aktivoituu vasta sen jälkeen, kun reaktio on saavuttanut korkean (> 70 ° C) lämpötiloissa, jotka eivät ole kohde-laajennus voidaan minimoida (19,20). "Hot start "Lähestymistapaa voidaan muodostaa käsikirjan lisäksi olennaisen reagenssia valintaa putki korkeissa lämpötiloissa. Lisääminen ssDNA sitova proteiini on myös raportoitu lisätä erityisiä vahvistinpiirejä. Lisätietoja käyttäjäystävällinen tapa on käyttää joko inhibitio tai inaktivoida DNA polymeraasi itse. Two types of inhibition of Taq DNA polymerase have been tried including oligonucleotide inhibition (21) and antibody (22) inhibition. Kahdenlaiset inhibitio Taq DNA-polymeraasi on kokeiltu myös oligonukleotidi inhibitio (21) ja vasta-aine (22) inhibitio. Highly specific oligonucleotide inhibitors of both Taq DNA polymerases have been produced. Erittäin oligonukleotidi estäjät sekä Taq DNA-polymeraasia on tuotettu. These selectively inhibit DNA polymerase activity at temperatures below 40°C and have been shown to function in Hot Start applications. Nämä valikoivasti estää DNA-polymeraasi toimintaa lämpötiloissa alle 40 ° C ja on osoittanut toimia Hot Start sovelluksia. Alternatively, one can use an antibody against Taq DNA polymerase. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää vasta-aine vastaan Taq DNA-polymeraasi. The antibody inhibits the DNA polymerase until the temperature of the PCR is such that the antibody is denatured at a temperature greater than 55°C, thereby releasing the enzyme. Vasta estää DNA-polymeraasi, kunnes lämpötila PCR on sellainen, että vasta-aine on denaturoitua, jonka lämpötila on yli 55 ° C, mikä vapauttaa entsyymiä. However there are disadvantages to this type of Hot Start conditions. Kuitenkin on olemassa haittoja tämän tyyppiseen Hot Start edellytykset. In this case, one needs an antibody for each different enzyme used in a PCR and for a large number of PCRs this can rise costs significantly. Tässä tapauksessa yksi tarvitsee vasta-aineen kanssa kunkin eri entsyymiä käytetään PCR-ja lukuisia PCRs tämä voi nousta kustannuksia merkittävästi. The most convenient form of Hot Start is to modify the DNA polymerase in such a way that it is inactive at room temperature (temperature-sensitive mutant), and is only re-activated following incubation at 95°C for 6-15 minutes (23). Kaikkein convenient form Hot Start on muuttaa DNA-polymeraasi siten, että se on neutraali huoneenlämmössä (lämpöherkkiä mutantti), ja se on vain aktivoitua uudelleen seuraavasti itämisaika on 95 ° C: ssa 6-15 minuuttia (23 ).
Because of its simplicity, PCR is a popular technique with a wide range of applications Koska sen yksinkertaisuus, PCR on suosittu tekniikka, jolla on laaja valikoima sovelluksia
including direct sequencing, genomic cloning, DNA typing, detection of infectious microorganisms, site-directed mutagenesis, prenatal genetic disease research, and analysis of allelic sequence variations (1,7,13,16) which depend on essentially three major advantages of the method: mukaan lukien suora sekvensointi, geenien kloonaus, DNA konekirjoitus-, selvittämis-tarttuvien mikro-organismien, sivustoihin suunnattu mutageneesi, hoitosuositus geneettisten sairauksien tutkimus ja analyysi allelic sekvenssi muunnelmia (1,7,13,16), jotka riippuvat pääasiassa kolme suurta hyötyä menetelmästä :
Speed and ease of use: DNA cloning by PCR can be performed in a relatively short amount of time, within a few hours. Usually, a PCR reaction consists of around 30 cycles each cycle containing a denaturation, synthesis and reannealing step, with an individual cycle typically taking 3 Nopeus ja helppokäyttöisyys: DNA kloonauksen PCR-menetelmällä voidaan suorittaa melko lyhyessä ajassa, muutaman tunnin kuluessa. Tavallisesti PCR-reaktion koostuu noin 30 sykliä jokaisella kierroksella, joka sisältää denaturointi, synteesi ja reannealing vaihe, jolloin yksittäisten syklin yleensä ottaen 3 
5 min in an automated thermal cycler. This is clearly quicker than the time required for cell-based DNA cloning, which could take weeks of time. Furthermore, it is quite easy to setup a PCR reaction and the use of a thermocycler machine is also easy. Some time is required for the design and synthesis of oligonucleotide primers, but this has been simplified by the availability of computer software for primer design and rapid commercial or academic synthesis of custom oligonucleotides. Optimization of PCR conditions may be required such as primer annealing temperature, magnesium concentration, and primer concentration. However, the creation of gradient PCR machines which allow a variety of primer annealing temperatures to be tested at the same time has greatly decreased the time required for this step. 5 min automatisoitu lämpösyklilaitteesta. Tämä on selvästi nopeampaa kuin tarvittava aika solu-pohjainen DNA: n kloonaus, jotka voivat kestää viikkoja aikaa. Lisäksi se on melko helppo asennus PCR-reaktion ja käyttö, thermocycler kone on myös helppoa. Jonkin aikaa on välttämätön suunnittelu ja synteesi oligonukleotidi pohjamaaleina, mutta tämä on yksinkertaistettava saatavuus tietokoneohjelmistot, alukkeet suunnittelu ja nopea kaupallista tai akateemista synteesi mukautetun oligonucleotides. optimointi PCR-olosuhteita voidaan tarvita esimerkiksi alukkeet hehkutus lämpötila-, magnesium-pitoisuus, ja alukkeet keskittymä. kuitenkin luomista kaltevuus PCR-koneet, jotka mahdollistavat eri primeri hehkutus lämpötilat, jotka on testattu samaan aikaan on merkittävästi vähentynyt, kun tarvitaan tässä vaiheessa. Once the optimal conditions for a reaction have been obtained, the reaction can then be simply repeated (1,7,13,16). Kun optimaaliset edellytykset, joiden reaktio on saatu reaktio voidaan sitten yksinkertaisesti toistettava (1,7,13,16).
Sensitivity: PCR is capable of amplifying sequences from minute amounts of target DNA, even the DNA from a single cell (24). Such exquisite sensitivity has afforded new methods of studying molecular pathogenesis and has found numerous applications in forensic science, in diagnosis, in genetic linkage analysis using single-sperm typing and in molecular paleontology studies, where samples may contain minute numbers of cells. Herkkyys: PCR pystyy täydentää sekvenssien osoitteesta minuutin määriä kohde-DNA: lla, jopa DNA yhdestä ainoasta solusta (24). Tällaiset erinomainen herkkyys on tarjonnut uusia menetelmiä tutkia molekyylitason patogeneesin ja on löytänyt moniin sovelluksiin rikosteknisen tiede-, diagnoosi, geneettisen linkage-analyysin, single-sperma tyypityksen ja molekyylitason paleontology tutkimuksia, joissa näytteet voivat sisältää minuutti määrä soluja. However, the extreme sensitivity of the method means that great care has to be taken to avoid contamination of the sample under investigation by external DNA, such as from minute amounts of cells from the operator (1,7,13,16). Kuitenkin äärimmäinen herkkyys menetelmä tarkoittaa, että suurta huolellisuutta on otettava huomioon, jotta vältetään saastuminen näytteen tutkimuksen ulkoisten DNA, esimerkiksi minuutin määriä soluja toimijan (1,7,13,16).
Robustness: A broad range of nucleic acid sources are suitable templates for PCR amplification. Purified DNAs from various species and sources have been amplified. PCR can permit amplification of specific sequences from material in which the DNA is badly degraded or embedded in a medium from which conventional DNA isolation is problematic. Häiriönsieto: A laaja nukleiinihappo lähteet ovat sopivia malleja PCR amplification. Puhdistettu nimettyjen kansallisten viranomaisten eri lajeja ja lähteitä on täydennetty. PCR voi sallia vahvistinpiirejä erityisiä sekvenssien materiaalista, jossa DNA on pahasti rappeutuneita tai upotettu keskipitkän josta tavanomaisen DNA: n eristäminen on ongelmallista. As a result, it is again very suitable for molecular anthropology and paleontology studies, for example the analysis of DNA recovered from archaeological remains. Tämän seurauksena se on jälleen erittäin sopiva molekyyli antropologinen ja paleontology tutkimuksia, esimerkiksi analyysi DNA toipunut arkeologisia jäänteitä. It has also been used successfully to amplify DNA from formalin-fixed or paraffin-embedded tissue samples, which has important applications in molecular pathology and, in some cases, genetic linkage studies. Sitä on myös käytetty menestyksekkäästi täydentää DNA: formaliini-kiinteä tai parafiini-sulautetut kudoksen näytteet, jotka on tärkeitä sovelluksia molecular pathology, ja joissakin tapauksissa geneettistä linkage tutkimuksia. Generally, the success of PCR amplification is greatest when target fragments are relatively abundant (1,7,13,16). Yleisesti ottaen menestys PCR amplification on suurin silloin, kun kohde-fragmentit ovat suhteellisen runsaasti (1,7,13,16).
Despite its huge popularity, PCR has certain limitations as a method for selectively cloning specific DNA sequences. Huolimatta sen valtavan suosion, PCR-menetelmällä on tiettyjä rajoituksia, koska menetelmä valikoivasti kloonaus erityisiä DNA-sekvenssejä.
In order to construct specific oligonucleotide primers that permit selective amplification of a particular DNA sequence, some prior sequence information is usually necessary. Jotta voidaan rakentaa erityisiä oligonukleotidi pohjamaaleina, että luvassa valikoiva vahvistaminen, erityisesti DNA-sekvenssi, jotkut ennen sekvenssitietojen on yleensä tarpeen. This normally means that the DNA region of interest has been partly characterized previously, often following prior cell-based DNA cloning. Tämä yleensä merkitsee sitä, että DNA-alueen edun on osittain ominaista aiemmin, usein seuraavat ennen solu-pohjainen DNA kloonauksen. However, a variety of approaches have been developed that reduce or even exclude the need for prior DNA sequence information concerning the target DNA. Previously uncharacterized DNA sequences can sometimes be cloned using PCR with degenerate oligonucleotides if they are members of a gene or repetitive DNA family at least one of whose members has previously been characterized. Kuitenkin erilaisia lähestymistapoja on kehitetty, että vähentää tai jopa poistaa tarpeen ennen DNA-sekvenssi tiedot, jotka koskevat kohde-DNA: lla. Aiemmin uncharacterized DNA-sekvenssit voi joskus olla klooni käyttäen PCR kanssa kärjistyä oligonucleotides, jos ne ovat jäseninä geenin tai toistuvia DNA-perhe ainakin yksi, jonka jäseniä on aiemmin ollut ominaista. In some cases, PCR can be used effectively without any prior sequence information concerning the target DNA to permit indiscriminateamplification of DNA sequences from a source of DNA that is present in extemely limited quantities. Joissakin tapauksissa PCR-menetelmää voidaan käyttää tehokkaasti ilman etukäteen sekvenssi tiedot, jotka koskevat kohde-DNA: lla, jotta indiscriminateamplification DNA-sekvenssien lähteestä, DNA, että se on läsnä extemely vähäisiä määriä. Therefore, although PCR can be applied to ensure whole genome amplification, it does not have the advantage of cell-based DNA cloning in offering a way of separating the individual DNA clones comprising a genomic DNA library. Näin ollen, vaikka PCR-menetelmää voidaan soveltaa sen varmistamiseksi koko genomin amplification, se ei ole etu, solu-pohjainen DNA kloonauksen tarjota tapa erottamalla yksittäiset DNA-klooneja, joka koostuu geenien DNA: n kirjastosta.
The amount of PCR product obtained in a single reaction is also much more limited than the amount that can be obtained using cell-based cloning where scale-up of the volumes of cell cultures is possible. Määrä PCR-tuote on saatu yksi ainoa reaktio on myös paljon pienempi kuin määrä, joka voidaan saada käyttämällä solu-pohjainen kloonaus, jossa mittakaava-ja tilavuudet soluviljelmillä on mahdollista. The efficiency of a PCR reaction will vary from template to template and according to various factors that are required to optimize the reaction but typically only comparatively small amounts of product are achieved. Tehokkuus PCR-reaktio voi vaihdella template Malli mukaan eri tekijöistä, jotka ovat tarpeen optimoida reaktio, mutta tyypillisesti vain suhteellisen pieniä määriä tuote on saavutettu.
Although the theoretical yield of PCR is exponential, the actual yield of a PCR is much less indicating that the scheme is operating with less than its maximum potential. For example, the amount of product at each cycle eventually levels off. This plateau may be explained by the following phenomena. First, some of the template may never be available due to strand breaks or failure of the DNA to dissociated from other macromolecules during purification and the initial thermocycles. Secondly, the amount of enzyme is finite and eventually activity may decrease. Thirdly, as the concentration of the double-stranded product reaches high levels, competition increases between annealing of template (PCR product) to primer and reannealing of the complementary template strands (1,7,13). Vaikka teoreettinen saanto PCR on eksponentiaalinen, todellinen tuotto PCR on huomattavasti vähemmän osoittaa, että järjestelmä on toimintatukea, joissa on vähemmän kuin sen suurin mahdollinen. Esimerkiksi määrää tuotteen jokaisessa syklin lopulta tasot pois päältä. Tämä plateau voi selittyä ovat seuraavat ilmiöt. First, jotkut mallipohjaa ei voi koskaan olla saatavilla johtuu lohkon taukoja tai epäonnistumiseen, DNA, erottaa muiden makromolekyylien puhdistuksen aikana ja ensimmäiset thermocycles. Toiseksi, entsyymimäärä on rajallinen ja lopulta toiminta saattaa vähetä. Kolmanneksi, kuten keskittyminen kaksinkertaisen stranded tuote saavuttaa korkea, kilpailu lisääntyy välillä hehkutus templaatti (PCR-tuote) Pohjamaaleilla ja reannealing toisiaan täydentävä template osa (1,7,13).
An obvious and many times great disadvantage of PCR as a DNA cloning method has been the size range of the DNA sequences that can be cloned. Ilmeinen ja monta kertaa suuri haitta PCR, DNA kloonauksen menetelmä on ollut koko joukko DNA-sekvenssejä, jotka voidaan kloonata. Unlike cell-based DNA cloning where the size of cloned DNA sequences can approach 2 Mb, reported DNA sequences cloned by PCR have typically been in the 0.1 Toisin kuin solu-pohjainen DNA kloonaus, jossa koko kloonattu DNA-sekvenssit voi lähestyä 2 Mb, raportoitu DNA-sekvenssien kloonatun PCR-menetelmällä on tyypillisesti ollut, että 0,1 
5 kb size range, often at the lower end of this scale. 5 kb kokoa, usein alemman tässä mittakaavassa. Small fragments of DNA can usually be amplified easily by PCR, however it becomes increasingly more difficult to obtain efficient amplification as the desired product length increases. Pienet palaset DNA voidaan yleensä täydennetty helposti PCR-menetelmällä, mutta se tulee yhä vaikea saada tehokasta vahvistinpiirejä kuin haluttu tuote pituus kasvaa. Barnes (25) recognized a target length limitation to PCR amplification of DNA. He used a combination of a high level of an exonuclease-free, N-terminal deletion mutant of Taq DNA polymerase, Klentaq1, with a very low level of a thermostable DNA polymerase exhibiting a 3'-exonuclease activity (Pfu, Vent, or Deep Vent) to conduct high fidelity long PCR. Barnes (25) tunnustettu tavoite pituuden rajoittaminen PCR amplification DNA. Hän käytti yhdistelmä korkeaa tasoa, joka exonuclease-free-, N-terminaalista poistetaan mutantti, Taq DNA-polymeraasi, Klentaq1, joilla on hyvin alhainen, Termostabiilit DNA - polymeraasi näyttely yksi 3'-exonuclease toimintaa (Pfu, ilmanvaihtoaukon tai Deep vent) järjestää High Fidelity pitkän PCR. At least 35 kb of bacteriophage lambda can be amplified to high yields from 1 ng of lambda DNA template. Use of this method yielded increased base-pair fidelity, the ability to use PCR products as primers, and the maximum yield of target fragment. Other conditions have been identified for effective amplification of longer targets, including amplification of up to 22 kb of the beta-globin gene cluster from human genomic DNA and up to 42 kb from phaga lambda DNA (26). Vähintään 35 kb, bacteriophage lambda voi moninkertaistua korkean tuottavuuden 1 ng Lambda DNA-malliin. Käyttämällä tätä menetelmää tuottanut kasvoi base-pair uskollisuus, kyky käyttää PCR-tuotteiden pohjamaaleina, ja suurimman tuoton kohde-fragmentti. Muut ehdot on määritetty tehokas laajennus kestää tavoitteita, mukaan lukien vahvistinpiirejä jopa 22 kb, beta-globin gene cluster ihmisen geenien DNA: n ja jopa 42 kb osoitteesta phaga lambda DNA (26). The conditions for these long PCRs included increased pH, addition of glycerol and dimethyl sulfoxide, decreased denaturation times, increased extension times, and the use of a secondary thermostable DNA polymerase that possesses a 3'-to 5'-exonuclease, or "proofreading," activity. Edellytykset näiden pitkän PCRs sisälly kasvoi pH, lisäksi glyserolin ja Dimetyylisulfoksidi, laskivat denaturointi aikoina lisääntynyt laajentaminen kertaa, ja käyttää toissijaisena Termostabiilit DNA-polymeraasi, että lla on 3'-5'-exonuclease, tai "oikoluku, "Toiminta. The "long PCR" protocol maintained the specificity required for targets in genomic DNA by using lower levels of polymerase and temperature and salt conditions for specific primer annealing. The ability to amplify DNA sequences of 10-40 kb will bring the speed and simplicity of PCR to genomic mapping and sequencing and facilitate studies in molecular genetics (26). Generally, the conditions for long range PCR involve a combination of modifications to standard conditions with a two-polymerase system. "Pitkän PCR-protokolla säilyttää erityispiirteet vaadittavat tavoitteet geenien DNA käyttäen alempia polymeraasi ja lämpötila ja suola edellytykset erityisiä alukkeet hehkutus. Kyky täydentää DNA-sekvenssien, 10-40 kb tuo nopeus ja yksinkertaisuus PCR että geenien kartoitus ja sekvensointi ja helpottaa tutkimuksia molekyyli-genetiikan (26). Yleisesti ottaen edellytykset pitkän kantaman PCR mukaan yhdistelmä muutoksia vakioehdot kanssa kahden-polymeraasi-järjestelmä. This provides optimal levels of DNA polymerase and 3’to 5’ exonuclease activity which serves as a proofreading mechanism (16). Tämä tarjoaa optimaalisen tason DNA-polymeraasi ja 3'to 5 'exonuclease toimintaa, joka toimii oikoluku mekanismin (16).
Thermocyclers which automatically regulate temperatures for PCR cycling were introduced in 1986 (Figure 6). In addition to the advances in PCR reagents, new instruments for automated thermal cycling and for analyzing PCR products have been developed. New thermal cyclers have increased rates of heating, cooling, and heat transfer to modified reaction vessels. The reaction vessels accommodated by the first generation thermal cyclers (or even water baths and heating blocks) were standard plastic microfuge tubes. PCR amplification in thin capillary tubes allowed rapid thermal cycling, and DNA synthesis to 20s. The speed of the temperature changes achieved in these systems has allowed the precise definition of temperature optima for each individual step in the PCR cycle. The new generation thermal cyclers also accommodate more samples, have more precise thermal profiles, and are programmable (13). Thermocyclers joka automaattisesti säädellä lämpötiloja, PCR-pyöräily otettiin käyttöön vuonna 1986 (kuvio 6). Sen lisäksi, että kehitys PCR-reagenssit, uusia välineitä automaattiseen thermal pyöräilyn ja analysointia varten PCR-tuotteita on kehitetty. Uusissa lämpövoimaloissa cyclers on noussut siten, lämmitys-, jäähdytys, lämmön ja siirtää muutettu reaktion alusta. reaktio alusten vastata tekemällä ensimmäisen sukupolven thermal cyclers (tai jopa veden ammet ja lämmitys lohkot) oli standardin muovi mikrofugiputkeen putkiin. PCR amplification in thin capillary putkien ansiosta nopea lämpö-pyöräily, ja DNA-synteesi - 20s. Nopeus lämpötilan muutokset saavuttaa nämä järjestelmät on antanut tarkkaa määritelmää lämpötila Optima kunkin yksittäisen askel PCR-sykli. Uuden sukupolven thermal cyclers myös majoittaa lisää näytteitä, on täsmällisempi lämpö-profiileja, ja ne ovat ohjelmoitavien (13 ).
One of the least appreciated contributions to the widespread application of PCR has been the development of reliable automated chemistry for oligonucleotide synthesis. Until recently, the construction of a single oligonucleotide was a substantial task that could only be performed by a skilled organic chemist. Now it is possible to purchase either an oligonucleotide synthesizer that can be operated by a technician or the oligonucleotides themselves from a commercial or academic source. Multiplex oligonucleotide synthesis machines have been constructed with the aim of reducing the overall cost of synthesis (27,28). Yksi vähiten arvostettu maksuosuudet laajasta soveltamisesta PCR on ollut kehittämään luotettavia automaattisia kemian oligonukleotidi synteesiä. Viime aikoihin asti rakennusalan yhden ainoan oligonukleotidi oli merkittävä tehtävä, joka voidaan suorittaa ammattitaitoinen orgaanisten kemisti. Nyt se on mahdollista ostaa joko oligonukleotidi syntetisaattorin, että voi olla käytössä teknikon tai oligonucleotides itsensä kaupallista tai akateemista lähde. monenmoisia oligonukleotidi synteesi koneita ei ole rakennettu, joiden tavoitteena on vähentää kokonaiskustannuksia synteesi (27,28). As the oligonucleotides define the eventual PCR products, there is little doubt that in the absence of their ready supply, PCR would not have enjoyed the wide acceptance that it has gained today (13). Kuten oligonucleotides määritellä mahdolliset PCR-tuotteita, ei ole juurikaan epäilystä, että ilman niiden runsas tarjonta, PCR ei olisi nauttinut laajaa hyväksyntää, että se on saanut tänään (13).
Researchers agreed early on that the design of PCR primers was difficult and unreliable. Computer programs were devised to take all of the design criteria into account. Tutkijat sovittu jo varhaisessa vaiheessa, että suunnittelu PCR-alukkeet oli vaikeaa ja epäluotettavaa. Atk-ohjelmat olivat laatineet toteuttamaan kaikki suunnittelussa huomioon. One of the first programs written for primer design was Olga which made use of the implementation of Digital Research GEM (Graphics Environment Manager) on the Atari ST (29). Yksi ensimmäisistä ohjelmista kirjoitettu alukkeet suunnittelu oli Olga, joka teki käytöstä täytäntöönpanosta Digital Research GEM (Graphics Environment Manager), Atari ST (29). Olga was specifically suited to the polymerase chain reaction (PCR) allowing simultaneous analysis of two primer sequences. Olga oli nimenomaan sopii, että Polymeraasiketjureaktio (PCR), mahdollistaa samanaikaisen analyysin kahden alukkeet sekvenssejä. The advantage of Olga was that it provided in one program analyses for direct repeats, secondary structures and primer dimerization as well as several useful 'finishing' tools for workers engaged in PCR optimization and oligonucleotide syntheses. The Primer3 program at the Whitehead Institute is now thought to be the most reliable and versatile tool currently available (30). Etuna Olga oli se, että jos yhden ohjelman analyysit suoraan toistaa, keskiasteen rakenteet ja alukkeet dimerization sekä useita hyödyllisiä "viimeistely" välineitä työssä olevien työntekijöiden PCR-optimoinnin ja oligonukleotidi syntheses. Primer3 ohjelmaan Whiteheadin instituutti on nyt ajatellut on kaikkein luotettavin ja monipuolinen työkalu tällä hetkellä saatavilla (30).
PCRs can now be performed enabling the amplification of DNA fragments up to several kilobases in length by more than one million times their initial abundance. The procedure is highly automatable and requires just a few hours from beginning the thermocyling to product analysis. This was not the case previously, and the practical requirements for performing a PCR have been greatly simplified since the first manuscripts of the method (13). Today, most of the initial hitches or inefficiencies of the PCR have been worked out (8). Furthermore, PCR has expanded to include more than 270,000 articles (31). PCRs voidaan nyt suorittaa mahdollistaa amplification DNA-fragmentit jopa useita kilobases, joiden pituus on enemmän kuin yksi miljoona kertaa niiden alkuperäisen runsautta. Menettely on erittäin automaattisia ja vaatii vain muutaman tunnin alkua thermocyling tuotteen analyysi. Tämä ei ollut tapauksessa aiemmin, ja käytännön vaatimukset suorittamalla PCR on huomattavasti yksinkertaistettu, koska ensimmäisen käsikirjoitukset, että menetelmä (13). Nykyään suurin osa alkuperäisestä takerrellessa tai tehottomuutta, PCR on toiminut (8). Lisäksi PCR-menetelmällä on laajennettava koskemaan yli 270000 artikkelit (31).
Polymerase chain reaction is the most widely used method for in vitro DNA amplification however it requires thermal denaturation or thermocycling to separate the two DNA strands. In vivo , DNA is replicated by DNA polymerases with various accessory proteins. DNA helicase, a DNA polymerase accessory proteins acts to separate duplex DNA inside cells. Vincent et al. (32) have devised a new in vitro isothermal DNA amplification method by mimicking the in vivo replication mechanism. Helicase-dependent amplification (HDA) utilizes a DNA helicase to generate single-stranded templates for primer hybridization. Subsequent primer extension is then catalyzed by a DNA polymerase. HDA does not require an expensive thermocycler and thus PCR may be performed practically anywhere. In addition, it offers several advantages over other isothermal DNA amplification methods by having a simple reaction scheme and being a true isothermal reaction that can be performed at one temperature for the entire process. HDA offers great promise in the development of simple portable DNA diagnostic devices to be used in the field and at the point-of-care (32).
It is said the simplest and most convenient way to define PCR is as a technique . However, such a categorization eliminates the history of PCR's development as many individuals over the years contributed to the ideas behind the theory of PCR and the fine-tuning of the technique. The next simplest answer is to name an individual as the inventor of the polymerase chain reaction. Karry Mullis was awarded the Nobel Prize for Chemistry in 1993 for his discovery of PCR. However, this discovery is contested amongst many scientists, all of which may have contributed to unlocking this puzzle.
It has also been said that PCR did not exist until it was made to work in an experimental system. With this in mind, merely the thought of a concept is not sufficient; a concept must have been successfully been put into practice (33).
Although there is doubt as to the ultimate creator of PCR, and doubt as to the possibility that PCR may somehow or sometime be replaced, there is little doubt the impact that PCR has created over a short time span on the study of molecular biology and life.
References
1. Arnheim, N; Erlich, H; Polymerase Chain Reaction Strategy. ANNUAL REVIEW OF BIOCHEMISTRY, VOL. 61. XIV+1359P. , 1992. p. 131-156.
2. Appenzeller T. Democratizing the DNA sequence., Science , 1990 Mar 2, 247(4946).
3. Saiki R, K.; Scharf S; Faloona F; Mullis K. B; Horn G. T; Erlich HA; Arnheim N., Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia, Science , 1985 Dec 20, 230(4732):1350-4.
4. Southern, EM (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503-518.
5. Mullis K. B; Faloona F. A; Scharf S; Saiki R. K; Horn G; Erlich HA, Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology , 1986
6. Mullis K. B; Faloona FA Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology , 1987, 155:335-50.
7. Gibbs, RA; DNA Amplification by the Polymerase Chain Reaction. Analytical Chemistry, 1990, 62:1202-1214.
8. Mullis, KB; The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction, Scientific American, April 1990.
9. Kleppe, KE; Khorana , HG; (1971) J. Mol. Biol. 56, 341-346.
10. Keir, H; DNA polymerases from mammalian cells. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1965;4:81-128.
11. Fansler, BS; Eukaryotic DNA polymerases: their association with the nucleus and relationship to DNA replication. Int Rev Cytol. 1974;Suppl 4:363-415.
12. Saiki R. K; Gelfand D. H; Stoffel S; Scharf S. J; Higuchi R; Horn G. T; Mullis K. B; Erlich HA. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science , 1988 Jan 29, 239(4839):487-91.
13. Erlich, H. A; Gelfand, D; Sninsky, JJ Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction., Science , 1991, v.252, n.5013, 1643-1651.
14. Williams, JF; Optimization strategies for the polymerase chain reaction. Biotechniques. 1989 Jul-Aug;7(7):762-9.
15. Wu DY, Ugozzoli L, Pal BK, Qian J, Wallace RB. The effect of temperature and oligonucleotide primer length on the specificity and efficiency of amplification by the polymerase chain reaction. DNA Cell Biol. 1991 Apr;10(3):233-8.
16. Strachan, T; Read AP; Human Molecular Genetics 2 . 1999. John Wiley & Sons Inc. Chapter 6 Section 1.
17. Scharf S. J; Horn G. T; Erlich HA Direct cloning and sequence analysis of enzymatically amplified genomic sequences. Science , 1986 Sep 5, 233(4768):1076-8.
18. Cline J, Braman JC, Hogrefe HH; PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 1996 Sep 15;24(18):3546-51.
19. Falooea, F., Weiss, S., Ferre, F., Mullis, K. 1990 6th Int.Conf . AIDS . Abstr.
20. D’Aquila, RT, Bechtel, LJ, Videler, JA, Eron, JJ, Goeczyca, P., Kaplan, JC 1991. Nucleic Acids Res. 19:3749.
21. Dang C, Jayasena SD. Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR. J Mol Biol. 1996 Nov 29;264(2):268-78.
22. Kellogg DE, Rybalkin I, Chen S, Mukhamedova N, Vlasik T, Siebert PD, Chenchik A. TaqStart Antibody: "hot start" PCR facilitated by a neutralizing monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase. Biotechniques. 1994 Jun;16(6):1134-7.
23. Kermekchiev MB, Tzekov A, Barnes WM. Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR. Nucleic Acids Res. 2003 Nov 1;31(21):6139-47.
24. H. Li, UB Gyllenstein, X. Cui, RK Saiki, H. Ehrlich, and N. Arnheim. (1988). Amplification and analysis of DNA sequences in single human sperm and diploid cells Nature 335: 414-417.
25. Barnes WM.; PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates. Proc Natl Acad Sci US A. 1994 Mar 15;91(6):2216-20.
26. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA. Proc Natl Acad Sci US A. 1994 Jun 7;91(12):5695-9.
27. Caruthers MH, Barone AD, Beaucage SL, Dodds DR, Fisher EF, McBride LJ, Matteucci M, Stabinsky Z, Tang JY. Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides by the phosphoramidite method. Methods Enzymol. 1987;154:287-313.
28. Beattie KL, Logsdon NJ, Anderson RS, Espinosa-Lara JM, Maldonado-Rodriguez R, Frost JD 3rd. Gene synthesis technology: recent developments and future prospects. Biotechnol Appl Biochem. 1988 Dec;10(6):510-21.
29. Bridges CG. Olga--oligonucleotide primer design program for the Atari ST. Comput Appl Biosci. 1990 Apr;6(2):124-5.
30. Rozen S, Skaletsky H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 2000;132:365-86.
31. Location world wide web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed Search: “PCR”
32. Vincent M, Xu Y, Kong H. Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep. 2004 Aug;5(8):795-800. Epub 2004 Jul 09.
33. Paul Rabinow. Making PCR, A Story of Biotechnology , University of Chicago Press, 1996
Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved.
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
