Welcome to Molecular Station! Tervetuloa Molecular Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Sinun täytyy rekisteröityä ennen kuin voit lähettää meidän foorumeilla tai käyttää lisätoimintoja. Register Now! Register Now! Its Free and Fast! Sen vapaata ja nopeaa!

Already registered? Oletko jo rekisteröitynyt? Login now below. Login nyt alla.

User Name: User Name:

Password: Salasana:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Jo rekisteröity ja Unohditko salasanasi? Click below to recover it. Klikkaa alhaalta sitä takaisin.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Liity nyt - se on nopeaa ja ilmaista!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station on suurin verkosto, tutkijat, tiedemiehet ja tieteen ystäville!

Recent Forum Posts Uusi Forum Posts

Recombinant Protein Expression Rekombinantti Protein Expression

Copyright © Molecular Station 2006 Copyright © Molecular Station 2006

When you want to characterise a gene or protein of interest, you must first study its function. Kun haluat luonnehtimiseksi geenin tai proteiinin kiinnostaa, sinun täytyy ensin opiskella sen toimintaa. In this molecular era, obtaining a cDNA of your gene of interest is not difficult. Tässä molekyyli-aikakauden saamiseksi cDNA teidän geeni etua ei ole vaikeaa.

To express the cDNA as a protein, ie. Jos haluat ilmaista cDNA kuin proteiini eli. a recombinant protein, one can then easily perform functional studies using the recombinant purified protein. rekombinantti proteiini, joka voi sitten helposti suorittaa toiminnallisia tutkimuksia käyttäen rekombinantti puhdistettu proteiini.

Once you have a purified protein you can conduct: Kun sinulla on puhdistettu proteiini voit suorittaa:

• Protein-protein Interaction Experiments Proteiini-proteiini Vuorovaikutus Kokeilut
• Enzyme Kinetics Entsyymi Kinetics
• Functional Studies of the Protein Functional Studies olevan proteiinin
• Structural Studies - including protein crystallization, protein structure and NMR. Rakenteelliset Tutkimukset - mukaan lukien proteiini crystallization, proteiinin rakenne ja NMR.
• You can also use the protein to make antibodies for further experiments. Voit myös käyttää proteiinin tehdä vasta-aineiden lisäksi kokeita.

There are two main systems for the expression of recombinant protein. On olemassa kaksi pääasiallista järjestelmien ilmaus rekombinantti proteiini. Once you get your cDNA cloned, you must decide where you want to amplify your protein. Kun saat cDNA-klooni, sinun täytyy päättää, missä haluat laajentaa teidän proteiinia. This will be either a prokaryotic (bacterial) or eukaryotic (usually yeast or mammalian cell) system. Tämä on joko prokaryoottisesta (bakteerien) tai eukaryoottisten (yleensä hiivan tai nisäkässoluilla-järjestelmä). The choice of your system will decide which vector you will need to clone your cDNA into as there are different promoters which function in E.Coli and others that work best with yeast or mammalian systems. Valinta järjestelmä päättää, mitä vektorin sinun on klooni teidän cDNA, koska on olemassa eri vetäjiä jotka toimivat E. coli ja muut, että työ parhaiten hiivan tai nisäkkäistä.

So which protein expression system will you use? Joten mitä valkuaista ilmaisun järjestelmä käytät?

Systems for Protein Expression Järjestelmät Protein Expression

Prokaryotic Protein Expression Systems Prokaryoottisesta Protein Expression Systems

Prokaryotic recombinant protein expression systems have several advantages. Prokaryoottisesta rekombinantti proteiini ilmaisun järjestelmiä on useita etuja. These include ease of culture, and very rapid cell growth meaning you won't have to wait long to get protein from bacterial systems once you clone your cDNA. Näihin kuuluvat helppous kulttuuria, ja hyvin nopeasti solujen kasvua tarkoitettu sinun ei tarvitse odottaa kauan valkuaispitoisuus bakteeri-järjestelmissä, kun olet klooni teidän cDNA. Expression can be induced easily in bacterial protein expression systems using IPTG. Expression voidaan induced helposti bakteeri-proteiini ilmaisun järjestelmiä käyttäen IPTG. Also, purification is quite simple in prokaryotic expression systems and there are a plethora of commercial kits available for recombinant protein expression. Myös puhdistus on melko yksinkertainen prokaryoottisesta ilmaisua ja on olemassa lukuisia kaupallisia Pakit käytettävissä rekombinantti proteiini ilmaisua.

On the other hand, if you need to use your proteins for functional or enzymatic studies prokaryotic systems are a problem as most proteins become insoluble in inclusion bodies and are very difficult to recover as functional proteins. On the other hand, jos on tarvetta käyttää proteiinien toiminnallisia tai entsymaattisella tutkimukset prokaryoottisesta järjestelmät ovat ongelma, koska useimmat proteiinien tullut liukenematon sisällyttäminen elinten ja on hyvin vaikea saada takaisin kuin toiminnallisia proteiineja. Furthermore, most if not all post-translational modifications are not added by bacteria and therefore your protein of interest may not be functional. Lisäksi suurin osa, ellei kaikki post-translaatiotutkimuksessa muutokset eivät ole lisännyt bakteerien ja siksi teidän proteiinin etu ei voi olla toimiva. Enzymatic studies thus may be unfruitful. Enzymatic tutkimuksia voi siten olla unfruitful.

Eukaryotic Expression Systems Eukaryoottisten Expression Systems

Eukaryotic genes are not really “at home” in prokaryotic cells, even when they are expressed under the control of the prokaryotic vectors.  One reason is that E. coli cells frequently recognize the protein products of cloned eukaryotic genes as outsiders and destroy them.  Another is that prokaryotes do not carry out the same kinds of posttranslational modification as eukaryotes do.  For example, a protein that would ordinarily be coupled to sugars in a eukaryotic cell will be expressed as a bare protein when cloned in bacteria.  This can effect a protein’s activity or stability, or at least its response to antibodies.  A more serious problem is that the interior of a bacterial cell is not as conducive to proper folding of eukaryotic proteins as the interior of a eukaryotic cell.  Frequently, the result is improperly folded, inactive products of cloned genes. Eukaryoottisten geenit eivät ole todella "kotonaan" prokaryoottisten solujen edes silloin, kun ne ovat ilmaisseet valvonnassa oleva prokaryoottisesta vektorit. Yhtenä syynä on se, että E. coli-solujen usein tunnista proteiinituote kloonattujen eukaryoottisten geenejä kuin ulkopuolisten ja tuhota ne. Toinen on, että prokaryooteissa eivät suorita samankaltaisten posttranslational muunnoksesta eukaryotes tehdä. Esimerkiksi proteiini, joka tavallisesti on kytketty sokerit, joka eukaryoottisten solujen tulee joka ilmaistaan paljain proteiini, jolloin kloonatuista bakteereissa. Tämä voi voimaantulon proteiini 'S toimintaa tai vakautta, tai ainakin sen vastauksen vasta-aineita. Vakavampi ongelma on se, että sisätilojen mikrobisaastumiselle solu ei ole niin suotuisaa asianmukaiseen taitu eukaryoottisten proteiineja kuin sisätilat, eukaryoottisten solujen. Usein tuloksena on väärin taitettu, työelämän ulkopuolella olevien tuotteiden kloonattujen geenien.

Eukaryotic systems for the expression of protein include: Eukaryoottisten järjestelmien ilmaisua proteiinia sisältää:

• yeast hiivaa
• mammalian cells nisäkässoluilla
• baculovirus cells (insect) Bakulovirus solujen (hyönteinen)

All these systems are great eukaryotic systems for the expression of recombinant proteins. Kaikki nämä järjestelmät ovat hyvin eukaryoottisten järjestelmien ilmaus rekombinantti-proteiineihin.
Advantages of eukaryotic protein expression systems include the fact that you can get very high levels of expression. Edut eukaryoottisten proteiini ekspressiojärjestelmien sisältyä se, että voit saada erittäin korkean tason ilmaisua. The proteins are easy to purify using special tags which are included into the vectors including His, Myc and other tags. Proteiinit ovat helppoja puhdistaa käyttämällä erityisiä tageja, jotka on sisällytetty vektorit mukaan lukien hänen, Myc ja muut tunnisteet.

You can even purchase plasmids which secrete your protein into the media. Voit jopa ostaa plasmidit, jotka secrete teidän proteiini osaksi mediaa. Therefore you can keep growing your system and collecting the media without lysing your cells. Siksi voit jatkaa kasvuaan konettasi ja kerätä tiedotusvälineiden ilman lysing teidän soluja. There are no inclusion bodies to worry about and your proteins have intact post-translational modifications. Ei ole mitään osallisuutta elinten huolettomuus ja proteiinit ovat ehjät post-translaatiotutkimuksessa muutoksia. These are vital if you are studying the function of a protein and/or protein-protein interactions. Nämä ovat elintärkeitä, jos olet opiskelusta tehtävä proteiini-ja / tai proteiini-proteiini vuorovaikutusten.

The disadvantages of eukaryotic protein expression systems include the fact that eukaryotic cells do grow slower than prokaryotic cells. Haittoja eukaryoottisten proteiini ekspressiojärjestelmien sisältyä se, että eukaryoottisten solujen do kasvaa hitaammin kuin prokaryoottisten solujen.

Expression Vectors with Strong Promoters Ekspressiovektorit, jolla on vahvat Promoottorit

The main function of an expression vector is to yield the product of a gene- usually, the more product the better.  Therefore, expression vectors are ordinarily equipped with very strong promoters; the rationale is that the more mRNA that is produced, the more protein product will be made. Tärkein tehtävä ilmaisun vektori on tuottaa tuote geeni-yleensä, sitä enemmän tuote, sen parempi. Näin ollen ekspressiovektorit ovat yleensä varustettu erittäin vahva vetäjille, Ajatuksena on, että mitä enemmän mRNA, joka on tuotettu, sitä enemmän proteiinia tuote on tehty.
One such strong promoter is the trp (tryptophan operon) promoter.  It forms the basis for several expression vectors, including ptrpL1.  It has a trp promoter/operator region, followed by a ribosome binding site, and can be used directly as an expression vector by inserting a foreign gene into the ClaI site. Yksi tällainen voimakas promoottori on trp (tryptofaani operon) promoottori. Se muodostaa perustan useita ekspressiovektorit, mukaan lukien ptrpL1. Se on trp promoottori / toimija alueella, jota seurasi ribosome sitova asema, ja sitä voidaan käyttää suoraan ilmaisua vektori lisäämällä vieraan geenin huomioon sakon perus-sivustolla. Alternatively, the trp control region can be made “portable” by cutting it out with ClaI and HindIII and inserting it in front of a gene to be expressed in another vector Vaihtoehtoisesti, trp valvonta-alueella voidaan tehdä "kannettavat" leikkaamalla se pois sakon perus-ja HindIII ja lisäämällä sen eteen geeni on ilmaistava toisessa vektori

Inducible Expression Vectors Inducible ekspressiovektorit

It is usually advantageous to keep a cloned gene represed until we are ready to express it.  One reason is that eukaryotic proteins produced in large quantities in bacteria can be toxic.  Even if these proteins are not actually toxic, they can build up to auch great levels that they interfere with bacterial growth.  In either case, if the cloned gene were allowed to remain turned on constantly, the bacteria bearing the gene would never grow to a great enough concentration to produce meaningful quantities of protein product.  The solution is to keep the cloned gene turned off by placing it downstream of an inducible promoter that can be turned off. Se on yleensä edullista pitää kloonatun geenin represed kunnes olemme valmiita ilmaista se. Yhtenä syynä on se, että eukaryoottisten proteiinit tuotetaan suuria määriä bakteerit voivat olla myrkyllisiä. Vaikka näitä proteiineja ei varsinaisesti myrkyllisiä, ne voivat rakentaa enintään auch suuri tasolle, että ne häiritsevät bakteerien kasvua. Kummassakin tapauksessa, jos kloonatun geenin saivat jäädä päällä jatkuvasti, bakteerit, joissa geeni olisi koskaan kasvaa suuri riitä keskittyminen tuottaa tarkoituksenmukaista määriä proteiinia tuotteessa. Ratkaisuna on pidettävä että kloonatun geenin pois päältä asettamalla se loppupään on inducible promoottori, joka voi olla kytketty pois päältä.
The lac promoter is inducible to a certain extent, presumably remaining off until stimulated by the synthetic inducer isopropylthiogalactoside (IPTG).  However, the repression caused by the lac repressor is incomplete, and some expression of the cloned gene will be observed even in the absence of inducer.  One way around this problem is to express our gene in a plasmid or phagemid that carries its own lacI gene, as pBS does.  The excess repressor produced by such a vector keeps our cloned gene turned off until we are ready to induce it with IPTG. The lac promoottori on inducible jossain määrin, oletettavasti jäljellä pois, kunnes kannustanut synteettisen indusoi isopropylthiogalactoside (IPTG). Kuitenkin, sorto, joita aiheutuu lac repressor on epätäydellinen, ja jotkut ilmentymä, kloonatun geenin on havaittu jopa ilman , indusoi. Yksi tapa ympärille tämä ongelma on ilmaista geeni, joka plasmidi tai phagemid, joka kuljettaa omia lacI geeni, kuten PBS ei. ylittävät repressor tuotettu tällainen vektori pitää meidän kloonatun geenin pois päältä, kunnes olemme valmiita aiheuttaa se kanssa IPTG.
Another strategy is to use a tightly controlled promoter as the λ phage promoter PL. Toinen strategia on käyttää tiukasti valvotuissa promoottori kuin λ phage promoottori PL. Expression vectors with this promoter/operator system are cloned into host cells bearing a temperature-sensitive λ repressor gene (c1857).  As long as we keep the temperature of these cells relatively low (32°C ), the repressor functions, and no expression takes place.  However, when we raise the temperature to the nonpermissive level (42ºC), the temperature-sensitive repressor can no longer function and the cloned gene is induced. Ekspressiovektorit tämän promoottori / toimijan järjestelmä on kloonattu osaksi vastaanottavan soluja, joissa on lämpöherkkiä λ repressor geenin (c1857). Niin kauan kuin pidämme lämpötilan näiden solujen suhteellisen alhainen (32 ° C), repressor tehtäviä, eikä sananvapautta tapahtuu. kuitenkin, kun nostaa lämpötilaa, nonpermissive tasolla (42 º C), lämpöherkkiä repressor ei voi enää toimia ja kloonatun geenin on houkuteltu.

Expression Vectors that Produce Fusion Proteins Ekspressiovektorit, jotka tuottavat Fusion Proteins

When most expression vectors operate, they produce fusion proteins.  This might at first seem a disadvantage because the natural product of the inserted gene is not made.  However, the extra amino acids on the fusion protein can be a great help in purifying the protein product. Kun useimmat ekspressiovektorit toimivat, ne tuottavat fuusio proteiineja. Tämä saattaa aluksi tuntua epäedulliseen asemaan, koska luonnollinen tuote on lisätty geeni ei ole tehty. Kuitenkin ylimääräisiä aminohappoja, fuusio-proteiini voi olla suureksi avuksi puhdistava valkuaispitoisuuden tuote .

Consider the oligo-histidine expression vectors, one of which has the trade name pTrcHis.  These have a short sequence just upstream of the multiple cloning site that encodes a stretch of six histidines.  Thus, a protein expressed in such a vector will be a fusion protein with six histidines at its amino end.  Why would we want to attach six histidines to our protein?  Oligo-histidine regions like this have a high affinity for metals like nickel, so we can purify proteins that have such regions using nickel affinity chromatography.  The beauty of this method is its simplicity and speed.  After the bacteria have made the fusion protein, we simply lyse them, add the srude bacterial extract to a nickel affinity column, wash out all unbound proteins, then release the fusion protein with histidine or a histidine analog called imidazole.  This procedure allows us to harvest essentially pure fusion in only one step.  This is possible because very few if any natural proteins have oligo-histidine regions, so our fusion protein is essentially the only one that binds to the column. Harkitse oligo-histidiini ekspressiovektorit, joista yksi on kaupan nimi pTrcHis. Nämä ovat lyhyen sekvenssi juuri ennen moninkertainen kloonaus sivusto, joka koodaa korotettua kuuden histidines. Näin ollen proteiinin ilmaistuna tällainen vektori on fuusio proteiini kuuden histidines sen amino lopussa. Miksi haluamme liittää kuusi histidines meidän proteiini? Oligo-histidiini alueilla, kuten tässä on korkea affiniteetti metallit, kuten nikkeli, jotta voimme puhdistaa proteiineja, jotka ovat näille alueille käyttäen nikkeliä lankoussuhteista kromatografialla. Kauneuden tämä menetelmä on sen yksinkertaisuus ja nopeus. Jälkeen bakteerit ovat fuusio-proteiini, emme yksinkertaisesti lyse niitä, lisätä srude bakteeri-uute, nikkelin lankoussuhteista sarake, pese kaikki sitomattomiin proteiinit, sitten release fuusio-proteiini, histidiini tai yksi histidiini analoginen kutsutaan imidatsoli. Tämä menettely mahdollistaa meille sadon puhtaille fuusio vain yksi askel. Tämä on mahdollista, koska hyvin harvat, jos kaikki luonnolliset proteiinit ovat oligo-histidiini-alueilla, joten fuusio-proteiini on pohjimmiltaan vain yksi, että sitoutuu sarakkeessa .

What if we want our protein free of the oligo-histidine tag? Mitä jos haluamme, että proteiini vapaa, oligo-histidiini-koodia?

The designers of these vectors have thoughtfully provided a way to remove it.  Just before the multiple cloning site, there is a coding region for a stretch of amino acids recognized by the proteolytic enzyme enterokinase.  So we can use enterokinase to cleave the fusion protein into two parts:  the oligo-histidine tag and the protein we want. Suunnittelijat nämä vektorit ovat huolellisesti tarjonnut tapa poistaa se. Juuri ennen useita kloonaus sivusto on koodaava alue korotettua aminohappojen hyväksymä proteolyyttiset entsyymin enterokinase. Niinpä voimme käyttää enterokinase on siis fuusio-proteiini - kahteen osaan: oligo-histidiini-koodia ja proteiinin haluamme. The site recognized by enterokinase is very rare, and the chance that it exists in our protein is insignificant.  Thus, our protein should not be chopped up as we are removing its oligo-histidine tag.  If we want, we can run the enterokinase-cleaved protein through the nickel column once more to separate the oligo-hisitidine fragments from the protein of interest. Sivustolla on tunnustanut enterokinase on erittäin harvinainen, ja mahdollisuutta, että se on olemassa meidän proteiinipitoisuus on vähäinen. Näin ollen meidän proteiinin ei pitäisi halkova jalkeilla koska olemme poistamalla sen oligo-histidiini-koodia. Jos haluamme, voimme ajaa enterokinase - cleaved proteiinin kautta nikkelin sarakkeessa jälleen kerran erottaa oligo-hisitidine fragmentit, proteiinin etua.

λ phages have also served as the basis for expression vectors;  one designed specifically for this purpose is λgt11.  This phage contains a lac control region followed by the lacZ gene.  The cloning sites are located within the lacZ gene, so products of a gene inserted into this vector will be fusion proteins with a leader of B-galactosidase. λ phages on myös toiminut pohjana ekspressiovektorit, yksi on suunniteltu nimenomaan tätä tarkoitusta varten on λ gt11. phage sisältää lac valvonta-alueella, jota seuraa lacZ geenin. kloonaus sivustot sijaitsevat kanssa lacZ geenin, joten tuotteet geeni lisättiin tämän vektori on fuusio-proteiinit, joiden johtaja B-galactosidase.
The expression vector λgt11 has become a popular vehicle for making and screening cDNA libraries.  λgt11 allows us to screen a group of clones directly for the expression of the right protein.  The main ingredients required for this procedure are cDNA library in λgt11 and an antiserum directed against the protein of interest. Ilmaus vektorin λ gt11 on tullut suosittu ajoneuvo, päätöksenteon ja seulonta cDNA-kirjastoista. Λ gt11 antaa meille mahdollisuuden screen ryhmä klooneja suoraan ilmaisua oikeus proteiinia. Tärkeimpien raaka-aineiden tarvitaan tätä menettelyä on cDNA-kirjastoa λ gt11 ja antiseerumin suunnattu vastaan proteiinin etua.
We plate our λ phages with various cDNA inserts and blot the proteins released by each clone onto a support such as nitrocellulose.  Once we have transferred the proteins from each plaque to nitrocellulose, we probe with our antiserum.  Next, we look for antibody bound to protein from a particular plaque, using labeled protein A from Staphylococcus aureus.  This protein binds tightly to antibody and labels the corresponding spot on the nitrocellulose.  We detect this label by autoradiography or by phosphorimaging, then go to our master plate and pick the corresponding plaque.  Note that we are detecting a fusion protein, not the protein of interest itself.  Furthermore, it does not matter if we have cloned a whole cDNA or not.  Our antiserum is a mixture of antibodies that will react with several different parts of our protein, so even a partial gene will do, as long as its coding region is cloned in the same orientation and reading frame as the B-galactosidase coding region. Meidän kilpi meidän λ phages eri cDNA insertit ja imupaperilla proteiinien vapautetaan kunkin kloonin johonkin tukeminen, esimerkiksi nitroselluloosa. Kun olemme siirtäneet proteiinien kunkin plaketti, nitroselluloosapohjaiset, meidän koetin kanssa antiseerumilla. Seuraavaksi odotamme vasta-aine sidottu proteiini tietystä plaketti käyttäen nimeltä proteiini A Staphylococcus aureus. Tämä proteiini sitoo tiukasti vasta-aine ja merkinnät vastaavat paikalla, nitroselluloosa. Havaitessamme etiketissä on autoradiography tai phosphorimaging, sitten meidän master levy ja valitse vastaava plaketti . Huomaa, että olemme havaitsemalla yksi fuusio-proteiinia, ei proteiinin edun itselleen. Lisäksi, se ei ole väliä, jos meillä on kloonata koko cDNA tai ei. Our antiseerumin on sekoitus vasta-aineita, jotka reagoivat useisiin eri osa proteiinin , Niin edes osittain geeni tekee, niin kauan kuin sen koodaava alue on kloonattu on samassa suuntautumiseen ja lukemisen kehykseen B-galactosidase koodaava alue.

For a quick recombinant protein expression review see: For a quick rekombinantti proteiini ilmaisun tarkastelua katso:

Recombinant Protein Systems Rekombinantti Proteiini Systems

Copyright © Molecular Station 2006 Copyright © Molecular Station 2006