Welcome to Molecular Station! Tervetuloa Molecular Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Sinun täytyy rekisteröityä ennen kuin voit lähettää meidän foorumeilla tai käyttää lisätoimintoja. Register Now! Register Now! Its Free and Fast! Sen vapaata ja nopeaa!

Already registered? Oletko jo rekisteröitynyt? Login now below. Login nyt alla.

User Name: User Name:

Password: Salasana:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Jo rekisteröity ja Unohditko salasanasi? Click below to recover it. Klikkaa alhaalta sitä takaisin.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Liity nyt - se on nopeaa ja ilmaista!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station on suurin verkosto, tutkijat, tiedemiehet ja tieteen ystäville!

Recent Forum Posts Uusi Forum Posts

Membrane Hybridization to Screen a Library Membrane hybridization ohjelmoimaan Kirjasto

Screening Libraries using Membrane Hybridization Seulonta Kirjastot käyttävät Membrane hybridization

Under the conditions of temperature and ion concentration found in cells, DNA is maintained in a duplex (two-stranded) structure by the hydrogen bonds that form betwen the A and T bases and G and C bases in each strand. Olosuhteissa lämpötilan ja ion concentration löytyvät solut, DNA: n on säilytettävä sillä duplex (kaksi-stranded) rakenne, jonka Vetysidokset, että lomake betwen A-ja T perustoja ja G ja C tukikohdat kunkin lohkon. DNA duplexes can be denatured into single strands by heating them, usually in a dilute salt solution (eg, 0.01 M NaCl), or by raising the pH above 11. DNA duplexes voi olla denaturoitu huomioon yhtenä osa-kuumentamalla niitä yleensä on laimeaan suola-liuosta (esim. 0,01 M NaCl), tai nostamalla pH-arvoa yli 11. If the temperature is lowered and the ion concentration in the solution is raised, or if the pH is lowered to neutrality, the AT and GC base pairs reform between complementary single strands. Jos lämpötila on madallettu ja ionin konsentraatio liuoksessa on esitetty, tai jos pH-arvo on laskettu puolueettomuus, AT ja GC-pareja uudistuksen välillä täydentävät yhteen lohkoon.

This process goes by many names: renaturation, reassociation, hybridization, annealing. Tämä prosessi menee monia nimiä: renaturation, reassociation, hybridization, hehkutus. In a mixture of nucleic acids, only complementary single strands (or strands containing complementary regions) will reassociate; the extent of their reassociation is virtually unaffected by the presence of noncomplementary strands. Kun seos nukleiinihapot, vain täydentävinä yhteen lohkoon (tai osaa sisältävät täydentäviä alueita) reassociate, missä niiden reassociation on lähes ennallaan, jonka läsnäolo noncomplementary osaa. Such molecular hybridization can take place between two complementary strands of either DNA or RNA, or between an RNA strand and a DNA strand. Tällainen molekyyli hybridization voi tapahtua kahden täydentävää osaa joko DNA-tai RNA: ta, tai välillä RNA-lohkoon ja DNA strand. To utilize molecular hybridization in the detection of specific DNA clones, single stranded DNA from recombinant DNA molecules is attached to a solid support, commonly a nitrocellulose filter or treated nylon membrane. Voit käyttää molekyylitason hybridization, Spesifisen DNA-klooneja, yksittäinen stranded DNA: DNA-molekyylejä on liitetty vankkaa tukea, yhteisesti yksi nitroselluloosa suodattimen tai käsitelty nailon membrane. When a solution containing single0stranded nucleic acids is dried on such a membrane, the single strands become irreversibly bound to the solid support in a manner that leaves most of the bases available for hybridization to a complementary strand. Kun liuos sisältää single0stranded nukleiinihapot on kuivattu tällaisen kalvo, yhteinen osa tullut peruuttamattomasti sidottu kiinteään tukea tavalla, joka jättää suurimman osan perustaa käytettävissä hybridization on täydentävä lohkoon. Although the chemistry if this irreversible binding is not well understood, the procedure is very useful. Vaikka kemia, jos tämä peruuttamaton sitovia ei ole täysin ymmärretty, että menettely on erittäin hyödyllinen. The membrane is then incubated in a solution containing radioactively labeled single-stranded DNA (or RNA) that is complementary to some of the nucleic acid bound to the membrane. The membrane on sitten inkuboidaan liuoksessa, joka sisältää radioaktiivisesti merkittyinä single-stranded DNA-(tai RNA), joka täydentää joidenkin Nukleiinihapon sido, membrane.

Under hybridization conditions (near neutral pH, 40-65 C, 0.3-0.6 M NaCl), this labeled probe hybridizes to the complementary nucleic acid bound to the membrane. Under hybridization edellytykset (lähellä neutraalia pH, 40-65 C, 0.3-0.6 M NaCl), tämä nimeltä koetin hybridizes, täydentävät nukleiinihappo sido, membrane. Any excess probe that does not hybridize is washed away, and the labeled hybrids are detected by autoradiography of the filter. Jokainen ylimääräinen koetin, että ei hybridize on pesty pois, ja merkitty hybridit ovat havaita autoradiography, suodatetaan. The recombinant lamda virions present in plaques of a lawn of E. coli are transferred to a nylon membrane by placing the membrane on the surface of the petri dish. The rekombinantti Lamda virions läsnä muistolaatat, nurmikon E. coli ovat siirrettiin johonkin nailon membrane asettamalla kalvo, pinta-ala on petrimaljaan. Many of the viral particles in each plaque absorb to the surface of the membrane, but many virions remain in the plaques on the surface of the nutrient agar in the petri dish containing a large number of individual lamda clones is reproduced on the surface of the membrane. Monet virussaastumisen hiukkasia kussakin plaketti imevät sen pinta-ala on kalvo, mutta monet virions edelleen, muistolaatat, pinnan ravinteiden agar, petrimaljaan, joka sisältää suuren määrän yksittäisiä Lamda klooneja on toistettava pinta-ala on membrane .

The original petri dish is refrigerated to store the collection of lamda clones. Alkuperäinen petrimaljaan on jäähdytettyjä tallentaa kokoelma Lamda klooneja. The membrane is then incubated in an alkaline solution, which disrupts the virions, releasing and denaturing the encapsulated DNA. The membrane on sitten inkuboidaan vuonna emäksisellä ratkaisu, joka häiritsee virions, levittämisestä ja denaturoinnin koteloitujen DNA: ta. The membrane is then dried, fixing the recombinant lamda DNA to the membrane's surface. The membrane on sitten kuivatut, vahvistamisesta rekombinantti Lamda DNA-, kalvo pinnalla. Next, the membrane is incubated with a radiolabeled probe under hybridization conditions. Seuraava, kalvo on inkuboitava kanssa radioaktiivisesti koetin nojalla hybridization edellytykset. Unhybridized probe is washed away, and the filter is subjected to autoradiography. Unhybridized koetin pestään pois, ja suodatin on tehtävä autoradiography.

The appearence of a spot on the autoradiogram indicates the presence of a recombinant lamda clone containing DNA complementary to the probe. Ulkonäkö spot-autoradiogram osoittaa esiintyminen rekombinantti Lamda klooni sisältävät DNA täydentävät koetin. The position of the spot on the autoradiogram corresponds to the position on the original petri dish where that particular clone formed a plaque. Sijainti paikalla, autoradiogram vastaa sitä kantaa alkuperäiseen petrimaljaan, jos se erityisesti klooni muodostivat plaketin. Since the original petri dish still contains many infectioua virions in each plaque, viral particles from the identified clone can be recovered for replacing by aligning the autoradiogram and the petri dish and removing viral particles from the clone corresponding to the spot. Koska alkuperäinen petrimaljaan edelleen sisältää monia infectioua virions kussakin plaketti, virusperäinen hiukkaset, yksilöidyt klooni voidaan ottaa talteen korvaa yhdenmukaistamalla autoradiogram ja petrimaljaan ja poistamalla virusperäisen hiukkaset, klooni vastaava paikalla. A similar technique can be applied for screening a plasmid library in E.coli cells. Vastaavaa tekniikkaa voidaan soveltaa seulontaan yksi plasmidi kirjastoa E. coli soluja.