Welcome to Molecular Station! Tervetuloa Molecular Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Sinun täytyy rekisteröityä ennen kuin voit lähettää meidän foorumeilla tai käyttää lisätoimintoja. Register Now! Register Now! Its Free and Fast! Sen vapaata ja nopeaa!

Already registered? Oletko jo rekisteröitynyt? Login now below. Login nyt alla.

User Name: User Name:

Password: Salasana:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Jo rekisteröity ja Unohditko salasanasi? Click below to recover it. Klikkaa alhaalta sitä takaisin.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Liity nyt - se on nopeaa ja ilmaista!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station on suurin verkosto, tutkijat, tiedemiehet ja tieteen ystäville!

Recent Forum Posts Uusi Forum Posts

Mass Spectrometry Massaspekrometria

What is a Mass Spectrometer? Mikä on massaspektrometri?

A mass spectrometer is based on the simple fact that different chemicals have different masses, and this is what determines what chemicals are present in a sample. A-massaspektrometri perustana on yksinkertainen tosiasia, että eri kemikaaleja on erilaisia massoja, ja tämä on mitä määrittää, mitä kemikaaleja ovat läsnä näyte. There are many types of mass spectrometers that not only analyze the ions differently but produce different types of ions; however they all use electric and magnetic fields to change the path of ions in some way. On olemassa monia erityyppisiä massa erityisvaatimukset, että ei ainoastaan analysoi ionit eri tavalla, mutta tuottaa erilaisia ioneja, mutta ne kaikki käyttävät sähkö-ja magneettikenttien muuttaa polku ionit jollakin tavalla.

During the late 1980s and early 1990s, two new methods of sample ionization caused mass spectrometry to undergo a revolution in biopolymer analysis, namely ESI 38 and MALDI.39 Just over a decade ago, for the first time, mass spectrometric techniques that could measure the molecular masses of femtomole quantities of proteins in excess of 100 kDa, often to better than 0.01% accuracy, became widely available to protein chemists. Aikana 1980-luvun lopulla ja 1990-luvun alussa kaksi uutta menetelmät otoksen ionisaatiolla aiheuttanut massaspektrometria tehdään vallankumous biopolymeeriä analyysi eli ESI 38 ja MALDI.39 Hieman yli vuosikymmen sitten, ensimmäistä kertaa, massaspektrillä määritettyä tekniikoita, joita voitaisiin mitata molekyyli massojen femtomole määriä proteiineja, jotka ylittävät 100 kda, usein parempi kuin 0,01% tarkkuutta, tuli laajalti saatavilla proteiini kemistit. These methods are both successful in forming ions from large, labile biomolecules without significant degradation of the analyte. Nämä menetelmät ovat molemmat menestyksekkäästi muodostavat ionit suurista, labile biomolekyylien ilman merkittävää hajoamista, analyyttiä. Not only are they both sensitive techniques but also speedy – both MS and MS/MS sequence spectra can be acquired within seconds. Ei vain ovat molemmat herkkiä tekniikoita, mutta myös nopea - sekä MS-ja MS / MS-sekvenssi spektrien voi olla hankittu sekuntia. ESI and MALDI, due to their many differences, are complementary and many biopolymer laboratories have access to both techniques. ESI-ja MALDI, koska ne monet erot ovat toisiaan täydentäviä, ja monet biopolymeeriä laboratorioiden saada molempia tekniikoita.

Sample preparation: 2-Dimensional Electrophoresis and Mass Spectrometry Näytteen valmistus: 2-ulotteinen Elektroforeesi ja massaspektrometria

Sample separation, isolation and preparation for the mass spectrometric techniques generally, involves 2-DE (2-Dimenisional Electrophoresis), a technique that can separate as many as 5000 different proteins in a single experiment. Näytteen erottelu, eristäminen ja valmistelu massa määritettyä tekniikkaa yleensä, sisältää 2-DE (2-Dimenisional Elektroforeesi), tekniikan, joka voi erillisen jopa 5000 eri proteiineja yhden kokeen. In general, 2-DE is capable of separating proteins within an isoelectric point (pI) range of 3.5–10 and of molecular masses ranging from 6 to 300 kDa, as well as being able to distinguish between post-translationally modified proteins (eg phosphorylated) and their non-modified companions. Yleensä 2-DE pystyy erottamalla proteiineja, joka isoelectric point (PI) valikoima 3.5-10 ja molekyylitason massat vaihtelevat 6-300 kda, samoin kuin on voitava erottaa post-translationally muunnettuja proteiineja (esim. fosforyloituu ) Ja niiden muuntamattomien vastaan. Once separated, the protein components are revealed by staining techniques (eg silver stain, fluorescent stain, Coomassie blue) and once located they can then be extracted from the gel. Kun erotetaan, proteiini komponentit ovat ilmenneet värjäävä tekniikoita (esim. hopea-värjäys, fluoresoivalla väriaineella, Coomassie blue) ja kerran sijaitsevat he voivat olla peräisin geeliä. Proteins cannot easily be eluted from gels without the use of detergents, which are detrimental to the mass spectrometric analysis; additionally, large proteins tend to be heterogeneous (eg as a result of glycosylation) and so possesses no single molecular mass which can be related to the corresponding entry in a database. Proteiinit ei voida helposti eluoidaan geelit ilman käyttää pesuaineita, jotka ovat vahingollisia massa määritettyä analyysi; lisäksi suuria proteiineja on usein heterogeeninen (esim. seurauksena glycosylation) ja niin hänellä ei ole yhtä ainoaa molekyylimassa, joka voi liittyä vastaava pääsy tietokantaan. To overcome these obstacles, the elution step tends to be accomplished after the protein has been digested by an aqueous acetonitrile wash of an excised gel piece. Voit voittaa nämä esteet, eluutioliuottimen askel on taipumus toteutua jälkeen proteiini on pilkottu, jonka vesiliuosta asetonitriili pestä joka poistettu geeli pala. This increases the yield of extraction 5 and by using an in-gel digestion method employing trypsin, which has been described and is widely used as published or with minor modifications, produces a MS-compatible sample from which a protein identification can be made. Tämä lisää tuottoa uutto 5 ja käyttämällä in-geeliä digestiomenetelmällä tapahtuvan työllistävät trypsiini, joka on kuvattu ja sitä käytetään laajasti julkaistu tai pienin muutoksin, tuottaa MS-yhteensopivan näytteen, josta proteiinien tunnistaminen voidaan tehdä. The digestion step can be preceded by an optional reduction and alkylation step to cleave and block disulfide bridges that exist between cysteine residues. The digestion vaihe voi edeltää vapaaehtoinen vähentäminen ja alkylointi askel siis ja estää disulfidi siltojen, että välillä kysteiini jäämiä. Robotic systems have been developed to automate the excision of protein spots from the 2D-gel, to carry out the subsequent enzymatic digestion and to transfer the samples onto MALDI-MS target plates for the initial MS analysis. Robotti on kehitetty automatisoimiseksi excision proteiinin spotit, 2D-geeli, suorittaa myöhemmin entsymaattisella ruuansulatuksen ja siirtämään näytteet onto MALDI-MS kohdistaa maljoja alkuperäinen MS-analyysia. For many applications, the peptides recovered from in-gel digestions require concentration and purification before being analysed by mass spectrometry especially if ESI is the ionization method used. Monissa sovelluksissa, peptidejä toipunut-geeliä digestions vaativat keskittymistä ja puhdistus ennen analysoitava massaspektrometria varsinkin jos ESI on ionisaatiota käytetty menetelmä. Reversed phase high performance liquid Käänteinen vaihe korkean suorituskyvyn nestekromatografia
chromatography (HPLC) is one method of achieving this; another method involves the use of ZipTips (Millipore) (pipette tips packed with C18 material) or Poros R2 perfusion material (Perseptive Biosystems). (HPLC) on yksi keino tämän tavoitteen saavuttamiseksi; toista menetelmää liittyy käytön ZipTips (Millipore) (pipetin kärkiä täynnä C18 materiaali) tai Poros R2 perfuusio materiaalia (Perseptive Biosystems). Despite its widespread acceptance, the limitations of 2-DE include the exclusion of very small or very large proteins, very acidic or very basic proteins, as well as hydrophobic proteins such as membrane proteins. Huolimatta laajaa hyväksyntää, rajoitukset 2-DE sisältyy lukuun ottamatta hyvin pieniä tai erittäin suuria proteiineja, hyvin hapan tai hyvin perus proteiineja sekä hydrofobinen proteiineja, kuten kalvojen proteiineja. It is thought that Uskotaan, että
only 20% of the gel-loaded proteins can be visualised and analysed. vain 20%: n geeli-loaded proteiineja voidaan havainnollistaa ja analysoida. Other constraints are that the amount of sample that can be loaded is limited causing the non-observance of Muut rajoitteet ovat, että määrä näytettä, jotka voidaan lastata on rajoitettu aiheuttaa noudattamatta jättämisestä
low concentration proteins and also that the most commonly used staining techniques have non-linear response factors. pitoisuus on vähäinen proteiinien ja myös, että yleisimmin käytetään värjäystä tekniikat ovat ei-lineaarisen vasteen. In practice, 2-DE is a labour intensive process involving manual handling steps that offer the opportunity for impurities such as keratin to contaminate the samples. Käytännössä 2-DE on työvoiman intensiivinen prosessi, johon liittyy manuaalinen käsittely vaiheet, jotka tarjoavat mahdollisuuden epäpuhtaudet kuten keratin saastuttaa näytteistä. One 2-D gel will take a day to complete and about one month for a complete structural analysis by MS, although automation can help both the contamination problem and speed up the analysis to some extent. Yksi 2-D geeli tekee päivittäin täydelliset ja noin yksi kuukausi täydellinen rakenteellinen analyysi, MS, vaikka automaatio voi auttaa sekä saastumisen ongelmaan ja nopeuttamaan analyysi jossain määrin.

Alternative protein separation techniques Vaihtoehtoiset proteiini erottaminen tekniikoita

Alternative, MS-compatible methods of protein preparation are under development but no one technology has emerged as a universal replacement. Vaihtoehtoiset, MS-yhteensopivia menetelmiä proteiinin valmistelu on parhaillaan kehitteillä, mutta kukaan ei tekniikka on muodostunut yleispalvelun korvaamisesta. These methods aim generally to interface the protein sample directly to MS/MS analyses thereby eliminating time-consuming sample preparation steps and the need for a preliminary MS analysis. Näiden menetelmien tavoitteena yleensä välisenä proteiini näytteestä suoraan MS / MS-analyysien siten poistaa aikaa vievää näytteen valmistelun vaiheet ja tarve alustavan MS-analyysia. Capillary isoelectric focusing (CIEF)-MS and preparative isoelectric focusing followed by size exclusion chromatography-MS are methods that have been compared in depth with 2-DE in terms of separation effciency, peak capacity, precision and robustness, with the former appearing the more favourable alternative.The direct analysis of complex peptide mixtures from a mixture of proteins using on-line, reversed phase high performance liquid chromatography (HPLC)-MS/MS has been used successfully as an alternative to 2DE and this has led onto multidimensional chromatography if greater peptide separation is desirable prior to the MS/MS analyses. Capillary isoelectric keskittyen (CIEF)-MS ja valmistelujaostoissa isoelectric keskittyen seurasi koko syrjäytymisen kromatografia-MS ovat menetelmiä, joita on verrattuna perusteellisesti 2-DE kannalta erottaminen hyötysuhteeseen, ruuhka-kapasiteetti, tarkkuus ja häiriönsietoa, entisen esiintyvät lisää myönteisen alternative.The suoran analyysin monimutkainen peptidi seoksia sekoitus proteiinien avulla on-line, käänteisfaasi vaihe korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC) -MS/MS on käytetty menestyksekkäästi kuin vaihtoehtona 2DE ja tämä on johtanut onto moniulotteinen kromatografia, jos suurempi peptidi erottaminen on toivottavaa, ennen kuin MS / MS analyysejä. Examples of two dimensional chromatography include anion or cation exchange followed by reversed phase HPLC and size exclusion chromatography followed by reversed phase HPLC. Esimerkkejä kahden dimensional kromatografiaa sisältävät anion tai Huo vaihdon jälkeen käänteisfaasi-HPLC: llä ja koko syrjäytymisen kromatografian jälkeen käänteisfaasin HPLC. Another, alternative approach has been to use combined solid-phase micro-extraction together with capillary electrophoresis(CE) coupled to ESI MS/MS for the analysis of a total protein tryptic digest. Toinen, vaihtoehtoinen lähestymistapa on ollut käyttämään yhdistettyjä kiinteän faasin mikro-uutto yhdessä capillary elektroforeesi (CE) kytkettäväksi ESI MS / MS-analyysiä varten on proteiinin kokonaismäärän tryptic sulatella. This method afforded high resolution separation of the peptide fragments allowing the identification of 80–90% of the proteins in this particular yeast ribosome complex. Tämä menetelmä tarjoaman korkean resoluution erottaminen, peptidi-fragmentit voidaan tunnistaa, 80-90% proteiineja tässä erityisesti hiivan ribosome monimutkainen. Coupling microfluidic devices to MS is a further strategy that combines sample handling and separation, as well as interfacing neatly with nano-ESI-MS analysis.A different approach for selective protein fractionation and identification uses ProteinChip technology (Ciphergen) which employs a surface capture method using antibodies or chemically modified surfaces to capture specific classes of proteins which are then analysed by MALDI-MS. Coupling mikrokanava laitteiden MS on uusi strategia, jossa yhdistyy näytteen käsittely ja erottelu sekä liittäminen siististi kanssa nano-ESI-MS analysis.A erilaista lähestymistapaa valikoiva proteiinien fraktiointi-ja tunnistamista käyttää ProteinChip tekniikka (Ciphergen), joka työllistää ala talteenoton menetelmän käyttäen vasta-aineita tai kemiallisesti muuntamattomat pintojen pyydystäminen tiettyihin proteiineja, jotka sitten analysoitiin MALDI-MS. This technique, known as Surface Enhanced Laser Desorption Ionization (SELDI)-MS35, has great potential for the comparison of the protein content of different samples. Tämä tekniikka, jota kutsutaan Pinta Enhanced Laser desorptio ionization (SELDI)-MS35 on paljon potentiaalia vertailu proteiinipitoisuus eri näytteet.