Molecular Biology Blog Molecular Biology Blog

Assaying DNA- Protein Interactions Assaying DNA-Protein Interactions

Learn about how to assay DNA-protein interactions. Opi kuinka assay DNA-proteiini vuorovaikutuksia.

Assaying DNAProtein Interactions Assaying DNAProtein vuorovaikutukset

There are four important techniques for assaying DNA-protein interactions. On neljä tärkeää tekniikoita assaying DNA-proteiini vuorovaikutuksia. The first two techniques (Filter Binding and Gel Mobility Shift) determine if your DNA is interacting with protein. Ensimmäiset kaksi tekniikkaa (suodatin sitomis-ja Gel Mobility Shift) määritellä, jos DNA on vuorovaikutuksessa proteiinia. The other two techniques (DNase Footprinting and DMS Footprinting) indicate where the target site of interaction between protein and DNA lies on the DNA. Kaksi muuta tekniikkaa (DNase jalanjäljen ja DMS jalanjäljen) osoittavat, joissa kohteena sivuilla vuorovaikutusta proteiinin ja DNA sijaitsee DNA.

Filter Binding Suodattimen Sitova

Nitrocellulose membrane filters are commonly used to filter-sterilize solutions. Nitroselluloosa kalvosuodattimia ovat yleisesti käytetty suodatin-steriloida ratkaisuja. Nitrocellulose filters can bind DNA, but only under certain conditions. Nitroselluloosa suodattimia voi sitoa DNA, mutta vain tietyin ehdoin. Singlestranded DNA binds readily to nitrocellulose, but double stranded DNA by itself does not. Singlestranded DNA sitoo helposti, nitroselluloosapohjaiset, mutta double stranded DNA ei sinänsä. On the other hand protein does bind, and if a protein is bound to double-stranded DNA the protein-DNA complex will bind. On the other hand proteiini ei sido, ja jos proteiini on velvollinen double-stranded DNA, proteiini-DNA monimutkainen sitoo. Please refer to Nitrocellulose Filter Binding Assay article for more information. Please refer to Nitroselluloosa suodatin Sitovat Pitoisuus artikkeli lisätietoja.

Gel Mobility Shift Geeli Mobility Shift

In order to measure DNA-protein interactions this technique relies on the simple fact that a small DNA has a much higher mobility in gel electrophoresis than the same DNA does when it is bound to a protein. Jotta toimenpide DNA-proteiini vuorovaikutusten tätä tekniikkaa on riippuvainen siitä yksinkertaisesta syystä, että pienen DNA on paljon suurempi liikkuvuus geelielektroforeesilla kuin saman DNA ei, kun se on sitoutunut proteiini. We therefore can label a sort double stranded DNA fragment, then mix it with a protein, and electrophorese the complex. Emme siis voi merkitä lajitella double stranded DNA-fragmentti, sitten sekoitetaan se proteiini, ja electrophorese monimutkaisia. Then we subject the gel in autoradiography to detect the labeled species. Sitten kohdistu-geelin autoradiography havaita merkitty lajeja. The small size of the DNA is important in this assay. Pienestä koosta DNA on tärkeä tässä assay. If a whole gene were used its mobility would already be very low, and the mobility shift caused by protein binding would be difficult to detect. Jos koko geenin käytettiin sen liikkuvuus olisi jo hyvin alhaiset, ja liikkuvuuden siirtyminen aiheuttanut proteiineihin olisi vaikea havaita. Therefore we must know approximately where the protein binds to the DNA so we can prepare a short restriction fragment, or even a synthetic double-stranded oligonucleotide that will contain the target site for the protein, but little else. Siksi meidän on tiedettävä, noin jossa proteiini sitoutuu DNA: n, jotta voimme valmistella lyhyt rajoitus fragmentti, tai jopa synteettistä double-stranded oligonukleotidi, joka sisältää tavoitteen sivusto proteiinipitoisuus, mutta vähän muuta.

DNase Footprinting DNase jalanjäljen

Once we know that a protein binds to a given DNA we can use footprinting to find out where the target site lies on the DNA. Kun me tiedämme, että proteiini sitoutuu tietyn DNA voimme käyttää jalanjäljen selville, mistä kohde-sivusto sijaitsee DNA. Dnase footprinting relies on the fact that a protein, by binding to DNA, covers the binding site and so protects it from attack by Dnase. Dnase jalanjäljen vetoaa siihen, että proteiini, sitoutumalla DNA, kattaa sitovia sivuston ja niin suojelee se hyökkäyksille, joita Dnase. In this sense it leaves a "footprint" on the DNA. Tässä mielessä se lähtee "peittoalue" DNA. The first step in a footprinting experiment is to end-label the DNA. Ensimmäinen askel jalanjäljen kokeilu on loppu-label-DNA. We can label either strand, but only one per experiment. Voimme merkinnässä joko lohkon, mutta vain yksi per kokeilu. Next, we bind the protein to the DNA. Seuraavaksi meidän sitovasti proteiinin DNA. Then we treat the DNA-protein complex with Dnase I under mild conditions (very little Dnase), so that an average of only one cut occurs per DNA molecule. Sitten me kohtelemme DNA-proteiinia monimutkaisemmaksi Dnase I lievästi edellytykset (hyvin vähän Dnase), niin että keskimäärin vain yhden palan tapahtuu / DNA-molekyylin. Next, we remove the protein from the DNA, separate the DNA strands, and electrophorese the resulting fragments on a high resolution polyacylamide gel alongside size markers. Seuraavaksi meidän poistaa peräisin olevan proteiinin DNA, erilliset DNA: n osaa, ja electrophorese tuloksena fragmentit, korkean erotuskyvyn polyacylamide geeli rinnalla koko-markkereita. Fragments will arise from the other end of the DNA as well, but we will not detect them because they are unlabeled. Fragments syntyy muista loppua, DNA niin hyvin, mutta meillä ei havaita, koska ne ovat otsikko. We always include a control with DNA alone (no protein), and usually use more than one protein concentration so we can see by the gradual disappearance of the bands in the footprint region that protection of the DNA depends on the concentration of the added protein. Olemme aina sisällettävä valvonta-DNA yksin (ei proteiinia), ja yleensä käyttää useampaa kuin yhden proteiinin pitoisuus, jotta voimme nähdä asteittainen katoaminen of the bands, jalanjäljen alueen suojelun DNA riippuu pitoisuus Lisätyn proteiinin. The footprint represents the region of DNA protected by the protein, and therefore tells us where the protein binds. Peittoalueen edustaa alueen DNA-suojattu ja proteiinia, ja siksi kertoo meille, missä proteiini sitoutuu.

DMS Footprinting DMS jalanjäljen

Dnase footprinting gives a good idea of the location of the binding site for the protein, but Dnase is a macromolecule and is therefore a rather blunt instrument for probing the fine details of the binding site. Dnase jalanjäljen antaa hyvän käsityksen sijainnista sitova sivusto proteiinipitoisuus, mutta Dnase on macromolecule ja on näin ollen varsin huono väline lisäkysymyksiä sakon yksityiskohtia koskevia sitovia sivustolle. Which means, that there may be gaps in the interaction between protein and DNA that Dnase would not fit into and therefore would not detect. Mitä tarkoittaa, että voi olla aukkoja vuorovaikutusta proteiinia ja DNA: n että Dnase ei sovi, ja siksi ei havaita. Moreover, DNA binding proteins frequently perturb the DNA within the binding region, distorting the double helix. Lisäksi DNA-sitovien proteiinien usein hämmentää DNA-sitova alue, vääristävät double helix. These perturbations are interesting, but are not generally detected by Dnase footprinting because the protein keeps the Dnase away. Nämä häiriöiden ovat mielenkiintoisia, mutta eivät ole yleensä havaittu Dnase jalanjäljen koska proteiini pitää Dnase pois. To do more detailed footprinting, we need a smaller molecule that can fit into the nooks and crannies of the DNA-protein complex and reveal more of the subtleties of the interaction. Voit tehdä yksityiskohtaisempia jalanjäljen, meidän on pienempi molekyyli, joka voi mahtua, että nooks ja kätkö, DNA-proteiini monimutkainen ja paljastaa enemmän vivahteiden vuorovaikutusta. A favorite tool for this job is the methylating agent dimethylsulfate (DMS). Suosikiksi väline tätä työtä on metylointireagenssina agent dimethylsulfate (DMS).

With DMS footprinting we start off in the same way as in Dnase footprinting, by end-labeling the DNA and binding the protein. With DMS jalanjäljen lähdemme pois samalla tavalla kuin Dnase jalanjäljen, loppuun mennessä merkintöjä DNA: n ja sitovat proteiini. Then we methylate the DNA-protein complex with DMS, using a mild treatment so that on average only one methylation even occurs per DNA molecule. Sitten methylate DNA-proteiinia monimutkaisemmaksi DMS, käyttämällä mietoa kohtelun niin, että keskimäärin vain yksi methylation jopa esiintyy per DNA-molekyylin. Next, we dislodge the protein, and treat the DNA with a reagent that removes methylated purines, creating apurinic sites (deoxyriboses without bases) on the DNA. Seuraavaksi meidän suistamaan proteiinipitoisuus, ja hoitaa DNA: n kanssa reagenssia, että poistetaan metyloidut purines, luomalla apurinic sivustoja (deoxyriboses ilman perustoista) DNA. Then we break the DNA at these apurinic sites. Sitten tauko DNA näitä apurinic sivustoja. These reactions are the same as the Maxam-Gilbert DNA sequencing reactions. Nämä reaktiot ovat samoja kuin Maxam-Gilbert DNA-sekvensointi reaktioita. Finally we electrophorese the DNA fragments and autoradiograph the gel to detect the labeled DNA bands. Lopuksi meidän electrophorese DNA-fragmentit ja autoradiograph geelin havaita merkitty DNA-kaistoilla. Each band ends next to a nucleotide that was methylated and thus unprotected by the protein. Jokainen bändi päättyy vieressä olevaa nukleotidien, että oli metyloidut ja siten suojaamattomien että proteiinia.

See the DNA Molecule in 3-Dimensions Katso DNA-molekyyli, 3-Mitat

deoxyribonucleic acid

Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved. Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | © 2005-2007 molekyylibiologian Station.com, Kaikki oikeudet pidätetään.

Send this page to a friend Send this page to a friend

Bioinformatics, Protocols, DNA RNA Protein Proteomics Bioinformatiikka, pöytäkirjat, DNA-RNA-Proteiini proteomiikka