Welcome to Molecular Station! Tervetuloa Molecular Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Sinun täytyy rekisteröityä ennen kuin voit lähettää meidän foorumeilla tai käyttää lisätoimintoja. Register Now! Register Now! Its Free and Fast! Sen vapaata ja nopeaa!

Already registered? Oletko jo rekisteröitynyt? Login now below. Login nyt alla.

User Name: User Name:

Password: Salasana:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Jo rekisteröity ja Unohditko salasanasi? Click below to recover it. Klikkaa alhaalta sitä takaisin.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Liity nyt - se on nopeaa ja ilmaista!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station on suurin verkosto, tutkijat, tiedemiehet ja tieteen ystäville!

Recent Forum Posts Uusi Forum Posts

DNA Protocols DNA: n pöytäkirjat

DNA Encyclopedia DNA Encyclopedia

DNA Bioinformatics DNA Bioinformatiikka

DNA Forum DNA-Forum

DNA Blog DNA-blogi

DNA News DNA Uutiset

DNA Books DNA Kirjat

DNA Footprinting DNA jalanjäljen

Copyright 2007 Molecular Station Copyright 2007 Molecular Station

Background on DNA Footprinting Tausta-DNA jalanjäljen

DNase footprinting is a molecular biology method that enables the detection of DNA-protein interactions by exploiting the property that a protein interacting with DNA will protect the DNA at that interaction site from restriction digestion or DNAase enzymatic cleavage. DNase jalanjäljen on molekyylibiologia menetelmä, joka mahdollistaa DNA-proteiini vuorovaikutusten hyödyntämällä omaisuutta, että proteiini vuorovaikutuksessa DNA aikoo suojella DNA on, että vuorovaikutus sivustolle rajoitus ruuansulatuksen tai DNAase entsymaattisella cleavage. A DNA restriction fragment which contains the specific binding site is labeled at one end, usually with 32P and used for footprinting. A-DNA: n rajoitus fragmentti, joka sisältää erityisiä sitovia sivuston nimi on toisessa päässä, yleensä 32p ja käytetään jalanjäljen.

Protein and DNA are allowed to hybridize and bind together. Proteiinin ja DNA voivat hybridize ja sitoa yhteen.

DNA footprinting utilizes the enzyme DNase I or d eoxyribo n ucleic acid nucle ase I in order to digest or cut away free radiolabeled (or labelled) DNA leaving the protein bound DNA protected. DNA jalanjäljen hyödyntää entsyymin DNase I tai d eoxyribo n ucleic acid nucle ase I jotta sulaminen tai leikata pois vapaan radioaktiivisesti (tai merkitty) DNA jättäen proteiineihin sitoutuviin DNA-suojattu. The DNA restriction fragments are treated lightly with DNase I, which makes single-strand breaks (nicks) in the DNA. DNA: n rajoitus palaset ovat kohdella kevyesti kanssa DNase I, joka tekee single-strand taukoja (nicks) DNA. A small amount of enzyme is used such that there is an average of less than 1 nick/strand. Pieni määrä entsyymiä käytetään siten, että siellä on keskimäärin vähemmän kuin 1 nick / strand. The reaction is then stopped, the DNA is denatured, and the mixture is run on a denaturing polyacrylamide sequencing gel. Reaktio on sitten lopetettu, DNA denaturoidaan, ja seos on näyttää denaturointivalmisteessa polyakryyliamideista sekvensointi geeli. These fragments separated by gel electrophoresis are exposed to detect the protected DNA area by analyzing the banding cleavage pattern on the gel. Nämä fragmentit erotetaan geelielektroforeesilla ovat alttiina havaitsemiseksi suojattu DNA-alueen analysoimalla ryhmittelyä cleavage kaava-geeliä.

The cleavage pattern of the DNA in the absence of a DNA binding protein, typically referred to as free DNA, is compared to the cleavage pattern of DNA in the presence of a DNA binding protein. The cleavage rakenteessa DNA koska ei ole olemassa DNA-sitova proteiini, tyypillisesti kutsutaan vapaan DNA: n, on verrattuna siihen cleavage rakenteessa DNA: n esiintyminen DNA sitova proteiini. If the protein binds DNA, the binding site is protected from enzymatic cleavage. Jos proteiini sitoutuu DNA, sitovat sivusto on suojattu entsymaattisella cleavage. This protection will result in a clear area on the gel which is referred to as the "footprint". Tämä suoja, tuloksena on selkeä alue, geelin, jota kutsutaan "peittoalue".

By varying the concentration of the DNA-binding protein, the binding affinity of the protein can be estimated according to the minimum concentration of protein at which a footprint is observed. Vaihtelemalla keskittyminen DNA-sitova proteiini, sitova yhtäläisyys, että proteiini voidaan arvioida sen mukaan, vähintään keskittyminen proteiini, jossa jalanjälki on havaittu.

DNAse Footprinting Buffer Recipes DNAse jalanjäljen Buffer Reseptejä

DNase Footprinting Binding Buffer Recipe DNase jalanjäljen Sitovat Buffer Resepti

2X w/o KCl / For 10mls: 2X w / o KCl / For 10mls:

amount: [final] määrä: [lopullinen]
Tris-HCl pH7.6: 500 ul of 1M: 50 mM Tris-HCl pH7.6: 500 ul-1M: 50 mM
MgCl2: 125ul of 1M: 12.5mM MgCl2: ta: 125ul, 1M: 12.5mm
EDTA: 2 ul of 0.5M: 1mM EDTA: 2 ul-0.5M: 1 mm
Glycerol: 2 mls: 20% Glyseroli: 2 MLS: 20%
DTT : 10 ul of 1M: 1 mM DTT: 10 ul-1M: 1 mM

Binding Buffer (Gel Shift buffer) Sitovat Buffer (Gel-Shift-puskuriin)

5X w/o KCL 5X w / o KCL
[final]: ingredient [lopullinen]: ainesosana
20%: gylerol 20%: gylerol
5mM: MgCl2 5mm: MgCl2: ta
2.5mM: EDTA 2,5 mm: EDTA
2.5mM: DTT 2,5 mm: DTT
250mM: NaCl 250mm: NaCl
50mM: Tris-HCL, pH 7.5 50mm: Tris-HCl, pH 7,5
0.25mg/ml: poly (dI-dC) poly (dI-dC) 0.25mg/ml: poly (DI-DC) poly (DI-DC)

Ca/Mg Buffer Ca / Mg Buffer

For 10mls For 10mls
CaCl2: 50 ul of 1M: 5 mM CaCl2: 50 ul-1M: 5 mM
MgCl2: 100 ul of 1M: 10 mM MgCl2: ta: 100 ul-1M: 10 mM

Loading Solution Ladataan Solution
0.1 M: NaOH:formamid (1:2 v/v) 0,1 M NaOH: formamid (1:2 v / v)
0.1%: xylene cyanol 0,1%: ksyleeni cyanol
0.1%: bromophenol blue 0,1%: bromophenol sininen

Stop Buffer Stop Buffer
10mls
NaCl: 400 ul of 5M: 200 mM NaCl: 400 ul-5M: 200 mm
EDTA: 600 ul of 0.5M: 30 mM EDTA: 600 ul-0.5M: 30 mm
SDS: 1 ml 10%: 1% SDS: 1 ml 10%: 1%

TEBe (Tris-EDTA-Beta mercap.) TEBe (Tris-EDTA-beeta mercap.)
Tris-HCl, pH 7.6: 500 ul of 1 M: 50 mM Tris-HCl, pH 7,6: 500 ul 1 M: 50 mM
EDTA: 2ul of 0.5 M: 1 mM EDTA: 2ul, 0,5 M: 1 mM
Beta-mercaptoethanol: 10 ul : 15mM Beta-merkaptoetanolia: 10 ul: 15mm

10 x K buffer 10 x K-puskuri
for 1 ml : 1 ml
Tris-HCl pH 7.5: 100 ul of 1 M: 100 mM Tris-HCl pH 7,5: 100 ul 1 M: 100 mm
MgCl2: 100 ul of 1 M: 100mM MgCl2: ta: 100 ul 1 M: 100mm
DTT: 50 ul of 1M: 50 mM DTT: 50 ul-1M: 50 mM
dH2O: 750 ul dH2O: 750 ul

DNAse Footprinting Protocol DNAse jalanjäljen pöytäkirjan

The DNA used usually contains the binding site of your protein of interest. DNA käytetään yleensä sisältää sitovia sivuston oman proteiinin etua. The DNA is purified, then digested with restriction fragments to be of an appopriate size. DNA on puhdistettu, pilkottu rajoitetusti fragmentit on joka vii koosta. The DNA fragment is labeled on one end (binding site > 25 bp from end). DNA-fragmentti on otsikoitu yhden loppuun (sitova sivuston> 25 bp osoitteesta lopussa).

One strand labeling can be accomplised by: Yksi lohkon Labeling voidaan accomplised:

1. isolating the fragment with restriction enzyme(s) containing 5' overhang, labeling with Klenow and the appropriate hot nucleotide. eristävät fragmentin kanssa rajoitus-entsyymin (s), joka sisältää 5 'ylitys, Labeling kanssa Klenow ja asianmukaiset kuuma nukleotidien. Then digest with an enzyme that removes one end. Sitten kokoelma, jolla on entsyymi, että poistetaan toinen pää.
2. isolating a fragment digested with a restriction enzyme that creates 5' and 3' end, labeling with Klenow will only label the 5' overhang. eristävät fragmentti pilkottu kanssa rajoitus-entsyymi, joka luo 5 'ja 3' End, Labeling kanssa Klenow vain merkintä 5 "ylitys.
3. As in "a" but with any enzyme and using polynucleotide kinase to label 3' end (kinase) and digesting off one of the ends with a second (third) restriction enzyme. Kuten "a", mutta kaikki entsyymi-ja käyttämällä polynukleotidit kinase merkitä 3 'end (kinase) ja digesting pois yksi niistä päättyy toisen (kolmannen) rajoitus entsyymi.
   (REMINDER: if labeling with Klenow, at the end of reaction add an excess of cold nucleotide of the same nucleotide that is labeled ( ie if you use dCTP32, add dCTP at the end) to make sure all ends are filled in equally. (HUOMAUTUS: Jos Labeling kanssa Klenow lopussa reaktio lisätä liikaa kylmää nukleotidien, sama nukleotidien, joka on otsikoitu (eli jos käytät dCTP32, lisätä dCTP lopussa) Varmista, että kaikki päättyy on täytetty tasapuolisesti.

For Klenow fragments, 0.3ug bring up to 100 ul in TE, heat kill Klenow at 68 °C for 10 minutes. For Klenow fragmentit, 0.3ug tuoda jopa 100 ul-TE, lämpö tappaa Klenow 68 ° C 10 minuuttia.

LABELING with one 5' overhang Labeling yhdellä 5 'ylitys

Sample RXN : 15 ng is need for each reaction. Näyte RXN: 15 ng on tarvetta kunkin reaktion. If making probe for many reactions JUST increase amount of DNA up to 300 ngs. Jos tehdään koetin monia reaktioita JUST lisätä määrää DNA enintään 300 kset.
15ng: DNA fragment 15ng: DNA-fragmentti
2 ul: 10x K buffer 2 ul: 10x K-puskuri
5 ul: 32P dCTP 3.33 uM 10 uCi/ul 5 ul: 32p dCTP 3,33 um 10 UCI / ul
2 ul: 2mM @ dA, dG dTTP 2 ul: 2mM @ DA, DG dTTP
1 ul: Klenow 1 ul: Klenow
20 ul Final volume, 37°C 30 min. 20 ul lopullinen tilavuus, 37 ° C 30 min.
--add 1 ul 10mM dNTP, 5 min @ 37°C . -- lisätään 1 ul 10mm dNTP, 5 min @ 37 ° C.

--add 80 ul TE. -- lisätään 80 ul TE. 68°C 15 minutes, put on ice. 68 ° C 15 minuuttia, laita jäällä.
--G-50 Spin Column (spin at about 2000g) -- G-50 Spin-sarake (spin noin 2000g)
--ADD 1/10 vol 3M Na0Ac, 2.5 volumes EtOH, Ice 30 mins, (Optional if [DNA] is = or > 3 ng/ul you might post G-50 directly) Microfuge 30 minutes. -- ADD 1 / 10 tilavuusprosenttia 3M Na0Ac, 2,5 volyymien EtOH, Ice 30 min, (valinnainen, jos [DNA] = tai> 3 ng / ul saatat post G-50 suoraan) mikrofugiputkeen 30 minuuttia.
--wash with 70% -- pese 70%
--Dry Bring up in 5ul -- Kuiva Tuokaa esiin 5ul

Binding Reaction For DNase Footprinting Sitovat Suhtautuminen For DNase jalanjäljen

Binding Reaction should have between 10 and 150mM KCl (more salt reduces binding but increases specificity). Sitovat Reaktion on oltava välillä 10 ja 150mm KCl (enemmän suolaa vähentää sitovia, mutta lisää spesifisyys). The typical concentration is 50mM. Tyypillinen pitoisuus on 50mm.

Protein DNA Binding: Proteiini DNA Sitovat:
25 ul of 2X Binding Buffer w/o KCl 25 ul-2X Sitovat Buffer w / o KCl
5ul of 3 ng/ul unilabeled DNA 5ul, 3 ng / ul unilabeled DNA
X ul of KCl to equal 10-150 mM KCl X-ul-KCl yhdenvertaiseen 10-150 mM KCl
dH20 to equal 50 ul minus volume for binding protien dH20 yhdenvertaiseen 50 ul miinus tilavuuden sitovia protien
1-3 Footprinting Units of DNA binding protein (or 10 to 160 ug of Crude nuclear extract) 1-3 jalanjäljen Yksiköt DNA sitovan proteiinin (tai 10-160 UG raakaöljy ydinvoima ote)

--mix gently, ice 10 minutes. -- Sekoitetaan varovasti, jää 10 minuuttia.

KEEP TIMING IN MIND, KEEP AJOITUS mielessä,
--ADD 50 ul of RT Ca/Mg solution, 18°C for 1 minute. -- Lisätään 50 ul rekisteröintiveron Ca / Mg ratkaisu, 18 ° C 1 minuutti.
--ADD 3 ul dilute RQ1 DNase (0.05 u/ul diluted in Tris) INCUBATE 1 minute. -- ADD 3 ul laimennetaan RQ1 DNase (0,05 ja / ul laimennettiin Tris) Inkuboidaan 1 minuutin ajan.
--STOP addition of 90 with 37°C STOP solutions, -- Stop lisääminen 90, 37 ° C STOP ratkaisuja,

--you should Phenol: CIA, and CIA extract, and Ethanol precipitate. -- sinun pitäisi Fenoli: CIA: n ja CIA: n ote, ja Etanoli sakka.
--RESUSPEND in 4ul of Loading Solution. -- RESUSPEND vuonna 4ul lastaus Solution.
--Run on 5% standard Urea-DNA sequencing gel (consider wedge gel) with appopriate loading lanes such as DNA ladder, uncut DNA, and controls. -- Juokse 5% standardi Urea-DNA-sekvensointi (geeli harkita wedge geeli) vii lastaus jonoja, kuten DNA-tikkaita, uncut DNA, ja valvontaa.

Analyze footprinting pattern. Analysoi jalanjäljen rakenteessa.

Troubleshooting and Problems? Vianmääritys ja Problems? See the DNAse Footprinting Forum! Katso DNAse jalanjäljen Forum!

For problems and troubleshooting DNAase footprinting, post a new thread to discuss it in the DNA Footprinting Forum ! Ongelmista ja vianetsintä DNAase jalanjäljen, post uusi viestiketju keskustella siitä, että DNA jalanjäljen Forum!

Other DNA Protocols and Methods Muita DNA: n pöytäkirjoja ja menetelmät

DNA Cloning Guide DNA Kloonaus-opas

DNA Gel Electrophoresis DNA geelielektroforeesilla

Restriction Enzyme Digestion - all you need to know ! Restriktio-entsyymianalyysi Digestion - kaikki mitä tarvitset tietää!

Genomic DNA Isolation Protocol Genomien DNA: n eristäminen pöytäkirjan

Baceteria DNA Isolation Baceteria DNA: n eristäminen

DNA Transformation - Contains History of DNA DNA Transformation - Sisältää Historia DNA

Find other protocols at our DNA Protocols external resource directory or see our DNA protocols . Etsi muita protokollia meidän DNA pöytäkirjojen ulkoisten resurssien hakemiston tai katso meidän DNA-protokollia.

Related:

DNA Microarray Protocols DNA Microarray pöytäkirjat

PCR Protocols PCR pöytäkirjat

DNA Bioinformatics DNA Bioinformatiikka

Visit DNA Bioinformatics . Käy DNA Bioinformatics.

DNA-Related News DNA-Related News

DNA News DNA Uutiset